抗菌肽分子由各种非共价力相互作用介导形成自组装体。驱动自组装过程的非共价力包括氢键、疏水性作用力、静电作用力、范德华作用力和 π-π 堆积力等，它们相互协同、联合驱动自组装过程，使得自组装朝着整个系统的能量最小方向发展。参与自组装的非共价相互作用的能量远低于共价键，但它们足以产生高度组织化和坚固的结构。分子自组装过程中涉及的非共价相互作用也是一个可逆过程， 分子的组装或解聚过程可由外部或内部因素如 pH、浓度、酶、温度等触发，如图1(a)所示。 

图1 温度响应肽原理及不同纳米肽表征图像. (a) 温度刺激响应自组装抗菌肽；(b) 在涂层上自组装的Fmoc-FFY水凝胶的SEM 图像；(c) RADA16 的 AFM 图像a和宏观图像b；(d) WMR2PA 自组装纳米结构的TEM图像; (e) NPG750 和 CPG2000 的 TEM 和 SEM 图像

1.1    氢键
    多肽可以通过主链上的酰胺基，侧链上的氨基、羟基和羧基等基团形成氢键。氢键是一种具有方向性、较强的分子内或分子间作用力。在短肽自组装的过程中，主链之间、侧链官能团之间以及侧链官能团与溶剂分子之间的氢键作用均发挥了重要作用，利用肽链间氢键作用可形成稳定的α-螺旋、β-折叠等二级结构。谷氨酰胺形成的分子间氢键是基于肽超分子结构中所有次级相互作用中最强的。基于这些原则，Xu 等人设计了一种自组装肽K3W(QL)6K2。通过分子间氢键和其他非共价力平衡，该肽可自组装形成超分子纳米纤维，具有出色的广谱抑菌活性，最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration, MIC)为5~20μmol/L。Shruti等人利用从节肢动物毒液中分离出的具有良好治疗效果的抗菌肽Anoplin及其衍生物，成功分析了Anoplin和AnoplinR5KT8W的结构稳定。研究表明，与Anoplin的构象相比，突变体R5KT8W的构象具有更近的氢键距离和更高的氢键径向分布函数，从而实现了更高的结构稳定性。AnoplinR5KT8是一种有前途的肽支架，具有治疗应用价值。总之，这些研究证明了氢键在多肽组装过程中发挥着重要作用，通过精确设计肽序列以利用氢键，不仅增强了自组装抗菌肽的结构稳定性，而且为开发新型治疗性肽支架提供了有力的工具。
1.2    π-π 堆积
    π-π 堆积在广义上是苯环之间的一种非共价力，π 电子共轭体系在满足一定特殊空间排布情况下展现出的弱相互作用，主要存在于含芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等）的多肽分子中。研究表明，π-π堆积作用可以诱导多肽分子定向排列，驱动多肽发生自组装。肽自组装中最简单和最广泛认可的基序之一是二苯丙氨酸基序(FF)，它是通过π-π 堆积相互作用驱动自组装的最简单的基序。FF 组装成纳米管，表现出膜渗透特性，导致应激相关基因的转录上调，引起细菌形态异常。FF 抗菌活性较弱，可以通过与其他芳香族部分如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)连接，形成新化合物Fmoc-FF，Fmoc-FF对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出中等的抗菌活性。Miryam等人发了一种基于自组装Fmoc-FFY三肽的抗菌涂层。Fmoc-FFpY肽(p:PO42−)酶解磷酸化成Fmoc-FFY，然后Fmoc-FFY肽通过π-π堆积作用与其他作用相协调自组装，获得水凝胶涂层，如图1(b)所示。这种涂层可以用于革兰氏阳性菌普遍存在的感染，例如血管内导管感染。这项工作为设计一种抗菌涂层提供了新的见解。丁文强等人[50]设计四肽WFFW通过π-π堆积形成纳米颗粒，直径约为80 nm，再通过促使RGD三肽和WFFW 四肽发生共组装（即形成RGDWFFW），直径增加为150 nm，赋予了WFFW四肽靶向癌细胞的功能。π-π堆积可促进含芳香族氨基酸多肽的定向排列和自组装，为自组装AMPs 的设计和应用提供了新的策略。显然，增加芳香性的化学修饰会增加π-π堆积的程度，从而导致自组装倾向随之增强。 
1.3    疏水作用力
    疏水效应是非极性或弱极性的分子或者官能团为了避免在水介质中暴露而自发聚集在一起的现象。在短肽自组装过程中，疏水效应主要来源于非极性氨基酸、烷基链、芳香基团等疏水性结构。脂肽分子在水介质中的组装行为也依赖于疏水作用的自发聚集。离子互补型肽作为一种具有前景的杀菌剂候选者，其独特的极性氨基酸和非极性氨基酸交替排列的结构，使其能够通过疏水残基驱动抗菌肽自组装。例如，肽RADA16-I就是离子互补型，可通过疏水作用力自组装形成水凝胶结构，如图1(c)所示，具有生物相容性好、免疫原性低、生物降解性好、降解产物无毒等优点。综上所述，疏水效应在肽自组装中起着核心作用，并与抗菌特性紧密相关。利用疏水作用，驱动多肽分子的自组装过程，形成具有特定生物活性的水凝胶等高级结构，在生物医学领域具有广泛的应用前景。因此，深入研究疏水效应在多肽自组装中的作用机制，对于开发新型自组装AMPs具有重要意义。 
1.4    静电作用
    在分子自组装中， 静电相互作用是最基本的作用力， 主要产生于带有电荷或具有偶极的分子之间。这种相互作用无方向性， 但键能较弱， 包括静电吸引、静电排斥， 分子内和分子间均有静电作用。静电作用可以通过改变环境溶液的 pH 或离子强度来调节， 进而调控多肽的自组装过程。由于不同氨基酸的等电点不同，因此在不同 pH 条件下氨基酸的带电状态也不同，从而能够通过调节 pH 来利用静电作用设计具有自组装能力的抗菌肽。如肽 KLD-12(KLDLKLDLKLDL)可利用静电作用力自组装形成水凝胶结构，具有良好的生物相容性[54] 。利用静电相互作用可以设计具有 pH 响应的自组装抗菌肽， 使其在药物递送系统和智能生物材料中展现出潜在的应用价值，凸显了静电相互作用在抗菌肽自组装开发中的重要作用。
2    化学修饰
    肽的翻译后修饰是使肽构建体多样化和产生新肽结构的重要策略。这些修饰主要作用于巯基、胺基或羟基官能团，以进一步帮助生物体在不同的细胞环境中动态地控制肽的结构和功能。这些化学修饰可以提高对内肽酶和外肽酶（包括胰蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶等） 的抗性以增强其生物活性和稳定性。不同的化学修饰，如脂肪酸修饰、 PEG  修饰、糖基化等都具有独特的优势，不同的修饰在操纵 AMPs 构象、调节疏水性和对目标微生物的活性方面显示出特定的益处。AMPs 的脂化可以提高肽的疏水性， 促进在细胞膜插入和孔形成，从而引起细菌膜不稳定；PEG  修饰则可以提高肽的生物相容性、降低其被蛋白酶水解的风险；AMPs 的糖基化可能提高其稳定性，并促进靶标结合和识别的特定局部构象。
2.1    脂肪酸修饰
    大多数具有良好抗菌活性的天然治疗性脂肽，通常是从芽孢杆菌、类芽孢杆菌、假单胞菌和枝顶孢菌等微生物中分离出来的。天然衍生的脂肽，包括达托霉素、多粘菌素B和多粘菌素E，已被美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准用于临床感染治疗。脂肽是通过AMPs链与脂肪酸共价结合而形成的，由于脂肪酸的加入，疏水性增强，可显著提高抗菌活性并有助于消除细菌生物膜。同时，脂肪酸为脂肽自组装提供了疏水作用力，形成纳米结构，从而进一步提高了蛋白酶稳定性。通过插入不同的脂肪酸调节肽的疏水性、二级结构和自组装倾向，是一种有前景的修饰方法。Lucia等人对天然肽myxinidin进行修饰，将C19H38O2（硬脂酸甲酯）与其末端赖氨酸的ε-氨基相连，合成肽两亲物(WMR2PA)。如图1(d)所示，WMR2PA 自组装形成的稳定纳米纤维可显著抑制铜绿假单胞菌和白色念珠菌生物膜的形成，并且该纳米纤维经过胰蛋白酶处理4小时后仍保持了抗菌活性。因此，通过引入适合的脂肪酸插入，可以调节肽的疏水性和自组装行为，为抗菌肽的优化提供了一种有效的策略。然而，AMPs的高疏水性通常意味着高毒性和高溶血活性，因此，在采用这种修饰策略时，必须在抗菌效果、生物相容性和稳定性之间找到恰当的平衡点。 
2.2    PEG 修饰
    PEG 修饰是一种简便而通用的策略，它利用了 PEG 这一由重复乙二醇结构组成的分子质量不等的高分子材料， PEG 可以通过与多肽上氨基、羟基及巯基等基团发生反应完成 PEG 修饰。PEG 修饰为纳米药物的研发开辟了新的途径， 是一种成功的 AMPs  自组装策略，可有效解决肽类药物在临床应用中的众多问题。研究表明，应用 PEG 可生成具有优异抗胰蛋白酶水解能力和低细胞毒性的 AMPs 衍生生物活性药物，为 AMPs 的进一步临床应用提供了理论基础。
    近年来，随着对PEG修饰技术研究的深入，修饰反应的专一性、修饰率以及修饰后多肽的治疗效果都有了显著提升。Hong等人将杆菌肽A的N端与聚乙二醇化PLGA共聚物缀合，构建出了聚乙二醇化自组装纳米颗粒，用于治疗侵袭性感染。另外，研究表明，对T9W(CT9W1000)的C端进行聚乙二醇化，可使其对铜绿假单胞菌的抑制作用增强，抗菌谱也有所拓宽。通过引入PEG偶联修饰，我们成功将猪源抗菌肽PG-1转化为有效的纳米抗菌剂，通过N端或C端偶联的PEG分别形成NPGn和CPGn，其中NPG750 和CPG2000分别形成纤维状和球形纳米结构，NPG750倾向于形成致密的纳米纤维网状结构，而CPG2000倾向于形成直径约为20nm的球形胶束，如图1(e)所示。PEG偶联修饰不仅大大提高了PG-1的蛋白水解抗性，而且提高了AMPs的抗菌活性，NPG750和CPG2000对大肠杆菌K88的MIC值分别为16和2 μg/mL。
    然而，通过聚乙二醇化改善 AMPs 的特性通常会牺牲抗菌效力。此外，分子量越大的聚乙二醇，生物降解性越差。同时，在人体器官和组织中聚集可能会引发免疫系统的过激反应，这是长期使用聚乙二醇化药物的一个潜在的问题。聚乙二醇化肽的性质受多种因素影响， 例如聚乙二醇分子的长度、构象和连接类型等。目前临床上使用的聚乙二醇化 AMPs 仍然缺乏，表明通过聚乙二醇化提高 AMPs  的蛋白水解稳定性实现临床应用并不容易， 但基于聚乙二醇化肽微凝胶等策略的提出， 有望减轻 AMPs 聚乙二醇化带来的负面影响，为实现 AMPs 临床应用提高了更多可能性。 
 2.3    糖基化修饰
    糖基化肽是一种多价糖缀合物，在治疗耐药菌感染和替代抗生素方面具有巨大潜力。糖基化作为一种重要的修饰策略，可扩展AMPs结构和功能的多样性。聚糖与肽上的特定残基共价连接，包括N-糖基化(Asn)、O-糖基化(Ser、Thr或Tyr)、C-糖基化(Trp)和S-糖基化(Cys)四种类型。聚糖基团的存在有助于实现蛋白质折叠、蛋白质识别、宿主免疫和靶点特异性，这对抗菌活性产生了积极影响。AMPs糖基化的应用在改变肽的生物学特性方面具有重要作用，可以掩盖蛋白酶切割位点，使AMPs难以被蛋白酶识别从而提高稳定性。特别是N-连接糖基化，已被证明能够有效改变肽的半衰期和生物利用度。例如，恩夫韦肽是一种新型抗逆转录病毒药物，通过糖基化可保护其免受肾脏快速清除，将其半衰期延长10倍以上，且不影响其对靶标病毒的敏感性。糖基化修饰较PEG修饰更可取，因为它不会引发由于引入合成聚合物而造成的安全问题，同时在技术实现上也更具可行性。此外，虽然增强的蛋白水解抗性和糖基化修饰之间存在关系，但用于AMPs糖基化修饰的糖基化位点、聚糖组成和长度等方面仍然需要更系统的研究。

参考文献：doi/10.1360/TB-2024-0390