尽管已确定了影响肽膜通透性的相关因素，但目前开发的克服低通透性的策略没有一种能普遍适用于所有肽，有些策略甚至会妨碍其生物活性。
应当指出的是，通常被认为可口服的肽类药物，其吸收率极低，生物利用度大多仅为个位数的低水平。不过，由于其极高的效力，口服给药时仍能发挥生物活性。
肽类物质很容易超出由利普金斯基（Lipinski）确定的与膜通透性相关的大小和分子量限制，文献中大多数可口服的肽类物质的分子量在500至1200道尔顿之间。分子大小对被动的细胞旁转运尤其具有限制性，因为据报道相邻上皮细胞之间的空间对于半径大于8-9埃的分子是不可渗透的。然而，使用一组环状模型肽进行的系统研究表明，刚性或亲脂性可能比大小对生物利用度更重要。因此，已经建立了许多化学修饰方法来限制肽的灵活性，使其保持预先形成的构象，从而增加被动渗透。这些化学修饰包括肽环化、N-甲基化和分子内氢键。
提高渗透性的主要方法之一是通过肽环化，因为几乎所有口服肽和大量高生物活性且可口服的天然产物都是环状的。大环肽还能够靶向结合面和蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），这是小分子疗法无法做到的。针对线性多肽链的环化化学方法已有大量报道，这些方法可以进行头尾环化，也可以通过不同的化学方法通过氨基酸侧链环化，近期的综述对此进行了总结。在 Caco-2 细胞试验中，与末端保护的线性对应物相比，环化被证明能提高膜渗透性，但并非所有情况都是如此。此外，环化增加了构象刚性，由于结合时熵损失减少，从而提高了亲和力，并能提高蛋白酶稳定性（见下文）。总体而言，大环肽的开发引起了极大的兴趣，因为来自自然界的例子非常有效，并且具有良好的药代动力学特性（例如环孢素 A）。因此，许多公司正在开发用于大环化合物库发现的平台。由于体外筛选方法的进步以及化学库的发展正在加速有前景的候选药物的发现，且新型环肽已作为首创化合物进入市场，预计这一兴趣将进一步增强。
酰胺氮的 N-甲基化通过降低顺式和反式肽键之间的能量差来增加顺式肽键的数量（图1）。此外，它还减少了肽主链中可参与氢键的游离 NH 基团的数量，从而减少了跨膜前去溶剂化的能量损失。这些效应会影响肽的渗透性，尽管尚未发现渗透性与 N-甲基基团的数量和位置、亲脂性和构象均一性之间存在直接关联，并且已有口服可用且未进行 N-甲基化的肽被报道。此外，多个 N-甲基化可能会阻碍临床开发，因为这可能会产生无法分离的构象体混合物，其中只有一个构象体具有生物活性。尽管如此，N-甲基化是一种稳定特定构象并影响氢键网络的有趣策略，并且已经报道了多种合成策略，例如溶液中的全局 N-甲基化和树脂上的全局 N-甲基化以及偶联 N-甲基化构建模块。然而，N-甲基化也会增加亲脂性，从而增加溶解性问题的风险，并且有报道称 N-甲基化的肽在三氟乙酸裂解过程中容易分解。生长抑素就是一个成功的例子，通过三个 N-甲基化，其口服生物利用度达到了 9.9%。非蛋白源氨基酸环丙氨酸，一种特殊的 N-甲基化形式，也被报道能增加细胞通透性。另一种减少氢键供体潜力从而提高通透性的 N-烷基化策略是使用肽素构建模块（图1）而非肽。这种策略还能提高蛋白酶稳定性，因为蛋白酶无法识别肽素键。
锁定特定三级结构的修饰也能提高渗透性。例如，α-烷基化通过使主链构象刚性化来提高渗透性，但其应用范围有限且会降低溶解度。许多口服有效的环肽中都存在顺式肽键，因为它们能稳定β-转角。β-转角还能增加主链刚性和内部氢键数量，从而形成有利于被动渗透性的构象。
环肽的被动渗透性增强也可通过形成更高程度的内环间氢键来实现，从而形成“闭合”构象。据推测，内氢键可屏蔽极性，这似乎是比整体亲脂性更重要的渗透性参数。最近报道了一种新型非蛋白源氨基酸（N,N-吡咯烷基谷氨酰胺），用于建立内侧链与主链间的氢键，从而提高渗透性和溶解性。
在分析口服天然化合物的结构特征时，环化、N-甲基化和分子内氢键在被动渗透性中的重要性变得显而易见。环孢素 A 是一种被广泛研究的天然存在的环肽，具有良好的口服生物利用度（30%），这源于其较高的被动渗透性，据推测这与其能够形成分子内氢键以及在“开放”和“闭合”构象之间容易相互转换的能力有关。有趣的是，几乎所有具有渗透性的天然环肽都存在分子内氢键和 N-甲基化。为了确定内部氢键的数量，氘交换 1H-NMR 实验已被证明是有用的，快速交换的酰胺 NH 数量越多，渗透性越低。最近的一项研究进一步强调了构象的重要性，并确定核心球状性是环肽膜渗透性的有前景的预测指标。最后，大侧链对主链酰胺的位阻效应比分子内氢键对渗透性的影响更大，这反映了总极性表面积对于细胞渗透性的重要性。
由于带电残基会降低被动膜通透性，因此最近有人提出一种策略，即通过前药策略用亲脂性烷基残基掩盖电荷，使药物保持在无活性或活性较低的状态，直到在体内通过生物转化释放出来。为了形成这些前药，带负电荷的羧基侧链与甲醇反应形成酯，而带正电荷的胍基则通过与己氧羰基反应形成氨基甲酸酯前药。前药向母体药物的转化由普遍存在的酯酶（如羧酸酯酶）实现。
为了实现主动运输，肽类可以与细胞表面受体的配体（如脂蛋白受体、转铁蛋白受体以及参与细胞黏附的受体）相连接。这些配体启动受体介导的摄取，其结合亲和力大多在低纳摩尔水平。营养物质（如糖和氨基酸）也能通过膜进行主动运输，因此它们被用于实现药物偶联物的主动运输。例如，八肽生长抑素的麦芽糖偶联衍生物使口服生物利用度提高了十倍，同时保持了药效学特性和受体选择性。在另一个例子中，乳糖单元被连接到具有高抗痛觉活性的口服可用的内啡肽-1 衍生物的 N 端。然而，尽管糖基化可以增加口服吸收和生物利用度，但它也可能降低受体亲和力，如加压素的例子所示。糖偶联物也是穿透血脑屏障的成功策略，如脑啡肽衍生物所例证的那样。除了提高膜通透性外，肽类糖基化还能改善溶解性和代谢稳定性。
短肽（通常由 5 至 30 个氨基酸组成）若含有多个碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸），则已被证实能够穿透生物屏障。这类所谓的细胞穿透肽（CPPs）于 20 世纪 90 年代初从人类免疫缺陷病毒的转录激活蛋白（Tat，GRKKRRQRRRPQ）和果蝇的触角同源结构域（穿膜肽 RQIKIWFQNRRMKWKK）中被发现。细胞穿透肽正被开发用于将各种不同类型的分子作为货物运输到细胞胞质中，目前已有超过 2000 种细胞穿透肽被报道，它们来自天然或合成来源。然而，并非所有细胞穿透肽都具有相同的效率，其效率被定义为胞质浓度与细胞外浓度的比值。一种由亲脂性芳香族氨基酸（如萘丙氨酸）组合而成且精氨酸残基数量减少的环状细胞穿透肽，其细胞内进入效率特别高（CPP9 为 62%，Tat 为 2%），且没有明显的膜扰动特性，因而不会导致溶血副作用。细胞内进入的机制仍在争论中，至少有两种不同的机制已被描述。（i）在低浓度下，细胞穿透肽（CPPs）被认为通过内吞作用进入细胞，从而定位于内体和溶酶体，它们必须逃逸出这些细胞器才能发挥治疗作用。内体逃逸的机制仍存在争议，不过 Sanhi 等人已报告了有关通过小囊泡出芽和塌陷机制的令人信服的研究。（ii）在高浓度下，某些细胞穿透肽能够以不依赖能量的方式穿过细胞膜直接进入细胞质。近期的综述强调了细胞穿透肽、对其细胞进入机制的研究以及增加内体逃逸的策略。
参考文献：doi.org/10.4155/fdd-2022-0005
