肽酰胺键会被多种蛋白酶和肽酶识别并切割，这些酶对线性肽序列和未改变的游离氨基和羧基末端尤其有效。因此，通过化学修饰N端（例如乙酰化）可以提高肽的稳定性。大多数肽酶识别L型氨基酸，因为大多数真核生物肽都由这种形式的氨基酸组成。因此，将L型氨基酸替换为相应的D型氨基酸（图1）可以使相应的肽更稳定。一个突出的例子是去氨加压素的开发。同样，N-甲基化会产生几乎不被肽酶识别的肽骨架。

图 1. 非天然氨基酸及酰胺键等价物的结构。

大量不寻常或非标准的氨基酸能够提高治疗性肽的蛋白水解稳定性，因为它们不会被人体蛋白酶识别。这些所谓的非蛋白生成氨基酸（NPAAs）不在人类遗传密码中。许多NPAAs存在于生物体中，比如细菌和真菌，它们由非核糖体肽合成酶生成，从而产生具有高活性、稳定性和渗透性的非核糖体肽。例如万古霉素、环孢素等肽类药物就包含这些氨基酸，而且已有超过800种天然存在的NPAAs被报道。此外，通过现代化学和酶促合成技术，合成非天然氨基酸变得越来越容易，这为肽类药物开辟了新的应用领域；例如，它们可以包含用于交联的反应性侧链。体外选择方法，如mRNA展示和深度突变扫描，使得构建包含NPAAs的多样化肽库成为可能。D型氨基酸尤其被用于提高蛋白水解稳定性，例如在生长抑素（L-Trp到D-Trp）的开发中。N-烷基化（主要是N-甲基化）氨基酸也已被成功应用于提高蛋白水解稳定性，其中包括P物质、内皮素、神经降压素等化合物。在此，肽主链和靠近N-烷基基团的侧链的构象自由度受到影响，倾向于促进顺式键构型。同样，α-取代氨基酸通过引入肽主链的构象限制来提高稳定性，并且在天然肽中经常被发现。例如，α-氨基丁酸（Aib）提高了脑啡肽、缓激肽和血管紧张素II的稳定性。包含改变主链的非天然氨基酸（如β-和γ-氨基酸）在整体肽主链中添加了碳原子，从而提高了蛋白水解稳定性，改善了体内药代动力学。β-氨基酸有多种版本（β2或β3，图1），取决于侧链的位置，而由于商业可得性，β3更为常见。

除了增强稳定性之外，非天然氨基酸（NPAAs）还能提高效力。用1-甲基色氨酸替代色氨酸使补体抑制剂化合物的亲和力提高了十倍，这很可能是通过与目标蛋白C3建立新的疏水接触或屏蔽结合口袋中保守的水分子实现的。用4-氟苯丙氨酸（4-氟-Phe）替代苯丙氨酸极大地增强了双环FXIIa抑制剂的抑制活性，而引入β-同型精氨酸和D型氨基酸（D-精氨酸、D-丝氨酸）则提高了蛋白水解稳定性。已获批的含NPAAs的肽类药物有依卡替班、兰瑞肽和亮丙瑞林。然而，侧链含有非天然化学结构单元的NPAAs存在不良影响的风险，例如毒性或免疫原性。

另一种提高稳定性的策略是使用异构氨基酸替代物，即用诸如还原酰胺、氮杂肽和肽类等异构体取代肽键。这种策略在设计蛋白酶抑制剂方面尤其成功，因为这些异构体常常能模拟肽键断裂的过渡态。

通过环化（见克服膜通透性的策略一文）来限制肽链也已被证明是一种成功的策略，能提高肽的稳定性，因为内肽酶无法接触到肽键，尤其是对于头尾环化而言，由于缺乏氨基和羧基末端，因此能抵御外肽酶的降解。其他主要为延长循环半衰期而开发的策略（例如，与聚乙二醇或Fc结构域偶联）也已被证明能提高偶联肽的酶稳定性，这是由于屏蔽效应所致。例如，Fc偶联物可能免受酶切，同时通过neonatal FC受体的再循环延长循环时间，这将在另一篇文章：延长循环半衰期一文中介绍。

最近，已发现一种源自前阿黑皮素原的12个氨基酸肽序列（NSSSSGSSGAGQ），当添加在肽的C端或N端时，可增强肽的血浆稳定性，如对胰高血糖素样肽-1（GLP-1）所示。该序列模块的稳定作用与白蛋白无关，表明其可能直接作用于肾清除率。

参考文献：doi.org/10.4155/fdd-2022-0005