01 前言
蛋白质表位可以作为构建细胞指导生物材料的基础。蛋白质是由称为肽的氨基酸链组成的，如果它们含有能够与特定细胞受体或抗体相互作用的生物活性序列，则称为表位。这些短氨基酸序列是蛋白质的主要“功能编码语言”，可以用作生物材料的基石。特别是，自组装肽是一种分子构建模块，具有在水环境中自组装成类似ECM的纳米纤维和水凝胶的高倾向。这种材料平台使肽表位在纳米纤维表面的呈现能够积极地与细胞相互作用，启动特定的细胞信号通路，作为治疗剂，或在体内靶向细胞和组织。自组装肽的多用途分子设计也允许3D纳米纤维水凝胶具有一系列机械，化学和生物特性，用于细胞培养，细胞传递和生物制造。
本文主要讨论了基于肽作为信号构建块的生物材料的设计。提供了一个肽表位库，可以作为合成水凝胶生物工程的分子工具箱，具有结构支持、信号传导和动态等生物功能。
02 多肽：直接信号传导
1. 促进细胞粘附和生长的肽序列
a.来源于纤维连接蛋白的细胞粘附表位。
RGD肽存在于纤维连接蛋白结构域FNIII9-10中，是研究最多的细胞粘附肽序列之一，RGD的掺入使合成的水凝胶具有细胞粘附特性。
b.细胞粘附表位来源于层粘连蛋白。
层粘连蛋白衍生的多肽，包括层粘连蛋白α-链上的IKVAV，层粘连蛋白β -链上的YIGSR， PDSGR， RYVVLPR，以及层粘连蛋白γ-链上的RNIAEIIKDI，可用于诱导血管生成和神经发生中的细胞聚集和簇形成。
c.由肌腱蛋白衍生的细胞粘附表位。
肌腱蛋白是一类参与神经发生、骨骼发生和血管发生的糖蛋白，其衍生的多肽可以作为功能编码工具来促进细胞粘附。例如肌腱蛋白衍生的八肽VFDNFVLK。
d.来源于胶原的细胞粘附表位。
胶原蛋白为软硬组织提供结构支持，与整合素结合以支持细胞附着。胶原蛋白超家族由46种不同的多肽链组成，这些多肽链根据其等级组织和功能的不同，超分子地组装成28种胶原蛋白。例如胶原样肽KOD ((PKG)4-(POG)4-(DOG)4)建立了强赖氨酸-天冬氨酸盐桥氢键，并能分层地组装成稳定的三重螺旋结构。胶原型衍生肽DGEA和GFOGER已在骨组织工程中进行了研究。I型胶原表位FPGER，作为FPGERGVEGPGP肽的一部分，可以在体外调节角质形成细胞和真皮成纤维细胞的迁移和增殖。
e.来源于钙黏蛋白的细胞粘附表位。
钙粘蛋白是一种跨膜细胞受体，负责细胞间的信号传递、细胞迁移和组织结构的维持。例如，N-钙粘蛋白对间充质干细胞凝聚至关重要，这是软骨形态发生的关键步骤。钙粘蛋白含有进化保守的三肽HAV，是一种重要的细胞间粘附介质。位于N-钙粘蛋白细胞外结构域-1的五肽HAVDI，通过抑制典型的Wnt/β-catenin信号传导，在体外触发人间质干细胞的软骨形成。
f.其他靶向整合素的细胞粘附表位。
鉴于整合素结合在介导血管生成、成骨和伤口愈合中的关键作用，整合素靶向是许多生物材料设计的关键考虑因素。例如GFPGER、RRETAWA、AGQWHRVSVRWG。
然而，在大多数已发表的研究中，RGD仍然是研究得最好的整合素结合肽（89%），其次是IKVAV (6%)， YIGSR（4%）和其他序列（1%）。
促进细胞粘附和生长的肽序列
2. 模拟生长因子的多肽序列
生长因子参与许多关键的细胞过程，如细胞增殖、迁移和分化，它们通过影响和指导干细胞表型来协调胚胎发育、组织稳态和修复；例如，骨形态发生蛋白（BMPs）在成骨过程中起关键作用，血管内皮生长因子（VEGF）促进血管生成，和转化生长因子（TGFβs）是软骨形成的重要调节因子。模拟生长因子肽可以加入到三维合成水凝胶中，避免全长生长因子的快速变性和清除，同时保证反应性、特异性和效率。
a.用于成骨、软骨和椎间盘形成的生长因子模拟肽。
BMP衍生的多肽可用于成骨应用。BMP是TGFβ超家族中的多功能生长因子，在心脏、大脑、软骨和骨骼发育中起着至关重要的作用。例如BMP-7衍生的肽表位KPSSAPTQLN，BMP-2衍生肽DWIVA。LIANAK是一种模拟TGFβ1的肽，以增加软骨基因的表达和ECM沉积。
b.血管生成的生长因子模拟肽。
来自VEGF螺旋区17-35的模仿VEGF的肽KLTWQELYQLKYKGI （KLT）与VEGF受体结合，激活细胞信号传导并促进毛细血管形成。在鸡胚绒毛膜尿囊膜实验中，KLT修饰的RADA16 - I水凝胶促进内皮细胞生长，诱导二维和三维毛细血管样小管的形成，以及新生血管的形成。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），也被称为FGF-2，也具有多种作用，包括血管生成和伤口愈合。FGF-2中的肽结构域106-120是FGF受体的部分激动剂。FGF-2模拟肽YRSRKYSSWYVALKR可用于制备血管生成肽纳米带水凝胶，在体外可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。骨连接素衍生的GHK三肽也具有促血管生成作用。来源于骨桥蛋白的七肽SVVYGLR与RADA16水凝胶偶联，可以刺激大鼠肺内皮细胞的体外血管生成，其水平与VEGF相当，可能用于心肌梗死的治疗。
c.用于神经发生的生长因子模拟肽。
人工合成的水凝胶可以用来促进神经再生。神经生长因子（NGF）促进神经突生长，调节外周感觉和交感细胞功能，脑源性生长因子（BDNF）提供神经保护和损伤神经元的再生。分别来源于NGF和BDNF的肽CTDIKGKCTGACDGKQC和RGIDKRHWNSQ可以促进神经突增殖和神经保护作用，类似于全长生长因子。
模拟生长因子的多肽序列
3.诱导免疫调节作用的肽序列
a. 具有天然抗菌作用的肽水凝胶。
由于正电荷的存在，阳离子两性肽具有内在的抗菌特性，促进带负电荷的细菌膜内的相互作用和交叉，导致细菌细胞死亡。如抗菌肽（AMP） WGIRRILKYGKRS （WMR），WMR肽在N端拥有一个额外的色氨酸氨基酸和更多带正电的精氨酸残基，这使得该序列具有较强的抗菌活性。蜂毒肽衍生肽GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ也可作为抗菌涂层。含有多个赖氨酸残基的生物相容性细菌破膜自组装肽体系（CASP-K6）对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）具有很强的杀菌作用。赖氨酸三肽连接的富含β-薄片的六肽（NAVSIQKKK）中赖氨酸的存在导致对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。
b. 具有固有抗菌作用的肽水凝胶。
可注射的水凝胶可以通过掺入具有抗菌特性的肽而制成抗菌。如PEP6R、MAX1和MARG1。以Fmoc-FFE和Nap-FFE肽为基础的低分子量肽水凝胶也具有对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的杀菌作用。此外，NapFFKK和NapFFFKK对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株表现出抗生物膜活性。
c. 增强T细胞和B细胞免疫反应的肽水凝胶。
多肽也可以作为化学定义的免疫佐剂；例如，基于Q11自组装结构域与卵清蛋白区域（即OVA323-339）串联的肽系统（O-Q11）包含T细胞和B细胞识别的抗原表位，在生理条件下自组装成纳米纤维。鼻内或皮下给药纳米纤维在没有佐剂的小鼠中引起强烈的免疫反应，引起高水平的免疫球蛋白，并促进T细胞活化，如果与H1N1流感表位结合，则会引起抗原反应
d. 免疫病毒的肽水凝胶。
肽疫苗基于肽表位，可引发针对特定病毒的免疫反应；例如，自组装多聚肽两亲系统增强了对肠病毒71 （EV71）的免疫力，EV71是一种引起手足口病的小核糖核酸病毒科病毒。肽两亲性纳米纤维显示了EV71的两个抗原表位，病毒颗粒1 （YPTFGEHKQEKDLEY）和3 (HYRAHARDGVFDYYT)，导致小鼠的体液和细胞免疫反应。这些免疫小鼠的血清能中和EV71并保护宿主细胞。
诱导免疫调节作用的肽序列
1. 结合生长因子的肽序列
a. 直接结合生长因子的肽。
可溶性生长因子通常用于体外和临床指导细胞命运。然而，它们通常以超生理剂量供应，以确保长期高浓度和有效，这会导致脱靶效应。例如可以结合BMP-2的YPVHST和结合TGF-β1 的HSNGLPL。
b.通过肝素模拟结构域和肝素结合结构域与生长因子结合的多肽
拟糖肽提供了一个结合多种生长因子的多功能工具箱。聚糖可与 300 多种分泌蛋白或膜结合蛋白（如生长因子、酶和趋化因子）结合，从而调节各种生物过程。例如，聚糖硫酸肝素和肝素可与多种生长因子杂交结合。与肝素磺酸结合生长因子（如BMP-2、BMP-4、FGF-1、FGF-2、VEGF、Shh和生长因子抑制剂Noggin）相互作用。
2. 结合其他ECM成分的肽序列
a. 肽通过选择性结合结合ECM分子。
结合多种分子和生物成分的能力是模拟天然组织组成复杂性的关键。例如，用hepsin靶向肽（IPLVVPL）修饰的聚甲基丙烯酸水凝胶选择性地结合过表达hepsin的肿瘤细胞。Nap-FFG肽可选择性结合并自组装成血小板表面的涂层，在体外阻止人类血小板聚集。Fmoc-二肽（即Fmoc-YN、Fmoc-YS、Fmoc-YL和Fmoc-VL）与β-乳球蛋白和牛血清白蛋白（BSA）的组装可通过改变氨基酸的极性来实现。基于FF的水凝胶也可以设计成在血红蛋白、肌红蛋白、血清白蛋白和纤维蛋白原存在下，通过利用共价希夫碱键进行自组装。基于酪氨酸和吡啶的凝胶可以设计超分子体系，选择性地结合镍（Ni2+）和氯离子（Cl−）。
b. 肽通过非选择性结合结合ECM分子。
多肽能够基于互补电荷和疏水性使ECM组分非选择性结合，从而允许多个大分子的结合和具有高水平结构层次和功能的材料组装。例如，带正电的PA （V3A3K3）和带负电的透明质酸在液-液界面上的非特异性相互作用导致扩散屏障的形成，随后肽和透明质酸共同组装成不同大小的结构。
c. 多肽结合离子调整有机-无机相互作用。
一些组织（如骨和牙釉质）的ECM是有机相和无机相的纳米复合材料，它们被分层组织以提供高强度和断裂韧性。在这些组织中，离子和矿物质（如钙和磷酸盐沉积物）的局部分布和浓度对确保结构和功能至关重要。例如，在骨骼中，有机相主要是I型胶原蛋白，而无机相是羟基磷灰石。多肽在生物矿化过程中具有重要的作用，指导有机-无机相互作用。特别是，羟基磷灰石聚集体及其晶体形成可以通过带负电和带正电的氨基酸（例如谷氨酸和精氨酸）与Ca2+和(PO4)3-离子的相互作用来调节。Fmoc-FF、Fmoc-R和羟基磷灰石相可以组合成多组分肽基骨再生支架。在该体系中，Fmoc-FF提供了结构刚性，而Fmoc-R由于存在精氨酸氨基酸而充当生物矿化的模板。这些含羟基磷灰石的水凝胶具有生物相容性和机械坚固性（硬度高达30千帕），因此可以作为骨再生研究的仿生支架应用于细胞培养。Fmoc-FF/S还可以与Fmoc-RGD和羟基磷灰石纳米晶体结合，在RGD基序上沉积来自R和D氨基酸的羟基磷灰石，并刺激Raw 264.7巨噬细胞向破骨细胞分化。此外，可以合理设计肽序列来指导生物矿化；例如，十二肽NPYHPTIPQSVH结合羟基磷灰石晶体表面，七肽MLPHHGA结合β-发针形成序列（MDG1），在成水泥细胞存在下指导羟基磷灰石形成。在牙釉质中，有机基质对牙釉质分层无机结构和力学性能的发展起着至关重要的作用。釉质ECM中带负电荷的大分子，包括糖蛋白和蛋白，如amelogenin、enamelin和amelotin，结合Ca2+离子，引发磷灰石晶体成核和生长。为了模拟这一过程，可以设计一种阴离子P11-4自组装肽的低粘度溶液，该溶液浸润并聚合到龋齿病变中，为羟基磷灰石成核提供仿生支架。该肽增加牙釉质矿化和体外新生结晶羟基磷灰石沉积，并在临床安全试验中实现牙釉质矿化。模仿牙釉质糖蛋白，26和32个氨基酸的淀粉原蛋白激发肽（P26和P32）可以作为水凝胶工程，促进多层羟基磷灰石晶体自下而上的形成在人臼齿切片。同样，牙釉质再矿化也可以通过较短的仿釉色素（amelogenin mimics），如LEAWPATDKTKREEVD和TKREEVD，以及来自牙本质磷酸蛋白的三肽基序（DSS）来实现。此外，从唾液中存在的一种蛋白质——甾体蛋白中提取的肽DDDEEKFLRRIGRFG可以控制氟磷灰石的形成。
结合其他ECM成分的肽序列
3. 肽序列创建动态基质
a. 由基质金属蛋白酶切割的肽
在健康组织中，ECM的沉积和降解受到严格调控，以确保体内平衡和基质周转。基质金属蛋白酶（MMPs）是锌依赖的内肽酶，在组织重塑和病理状态（如癌症）中经常过度表达。MMP敏感序列GPX1G*LX2G（其中*表示裂解位点，X1为A或L， X2为G）可以掺入到水凝胶中，以控制其酶降解并生成可切割的合成基质；例如，MMP-2敏感序列GTAGLIGQ可以作为PA水凝胶的可切割骨架。同样，肽FFAGLDD中的MMP-9敏感序列GL允许阿霉素从苯乙酰基PAs中体外释放，能够在MMP敏感位点降解后从胶束聚集体切换到纤维。以二苯丙氨酸为基础的肽水凝胶，包括一个MMP敏感的四肽（PLGL）连接到一个神经保护的六肽（NAVSIQ），可以注射到小鼠的大脑，并在MMP-9切割后释放六肽。含有MMP-1可切割表位（GPQGIWGQ）的自组装PA-透明质酸膜允许研究细胞-ECM重塑相互作用。许多MMP敏感肽已被优化以确保高酶敏感性和特异性，包括来自噬菌体展示文库的序列，如SGESPAYYTA（针对MMP-2优化），GAPFALRLV（针对MMP-3和MMP-7优化），GGYAELRMGG（针对MMP-11优化）和GPLGLWAR（针对MMP-13优化），GPQGIAGQ（对MMP-1， -2, -3, -7， -8和-9敏感），GPLGMRGL（可被MMP-13切割），以及序列VPMSMRGG和IPESLRAG。它们对MMP-1和MMP-2有很高的降解率。MMP敏感表位也被应用于动态基质的设计，诱导形态发生和增强细胞侵袭；例如，在PEG水凝胶中实现对MMP敏感的GPQGIWGQ表位，可以在体外实现肠道干细胞的蛋白水解重塑和器官发生。同样，通过调节含有MMP敏感的GPQGIWGQ序列的肝素基水凝胶的机制和可降解性，可以在体外实现肾小管形成。经MMP敏感PVGLIG表位修饰的藻酸盐凝胶可以传递人间充质干细胞，并在小鼠模型皮下植入后确保细胞入侵并随后降解。
b. 被其它酶切割的肽
除MMPs外，人们还探索了其他酶来制造可降解的肽基水凝胶；例如，显示一致序列RRX1SX2的PAs，其中X1可以是任何残基，X2必须是疏水残基，对蛋白激酶a （PKA）的切割敏感。因此，显示RRASV的PA纳米纤维会根据特定的酶进行组装和拆卸。当暴露于PKA时，纳米纤维被磷酸化并分解，而在ALP存在时，磷酸基团被劈裂，恢复系统的组装能力。丝氨酸蛋白酶α-凝乳胰蛋白酶对F残基旁边的KKFFVLK序列进行切割，从而产生不同倾向于形成纳米管或球形胶束的产物。类似地，组织蛋白酶敏感序列可以用来创建可降解的基质；例如，在以猪皮质骨片为底物的骨吸收研究中，移植了组织蛋白酶k敏感肽GGGMGPSGPWGGK的PEGDA水凝胶对破骨细胞有特异性降解，但对成骨细胞没有反应。组织蛋白酶-b可切割肽AVPIAQFRRG可以与促凋亡肽药物和阿霉素偶联，从而在荷瘤小鼠中实现高癌细胞特异性。此外，通过在β片纳米纤维和凝胶中加入酯骨架，它们可以通过水解降解。因此，降解可以使用特定的肽，并通过改变它们的二级结构或氨基酸组成来定制，以创建有利于细胞重塑和基质周转的细胞响应的动态生物材料。
肽序列创建动态基质
04水凝胶：具有协同肽基序
a. 细胞粘附表位的混合物
ECM组件通常协同工作；例如，纤维连接蛋白包含一个RGDS环和五肽PHSRN，它们在折叠蛋白上彼此靠近，当它们的距离为3.2 nm时，可以协同结合α5β1整合素。因此，一个在表位之间约3.2 nm处显示RGDS和PHSRN的多结构域肽系统可以在体外控制内皮细胞粘附和整合素上调。通过共同组装不同的表位显示链，可以将多个肽表位纳入同一水凝胶中；例如，携带RGDS、IKVAV、REDV和YIGSR的Q11可以根据肽表位混合的浓度以不同的组合组合成具有不同力学和生物特性的均质凝胶。有趣的是，RGDS和YIGSR表现出拮抗剂作用，而RGDS和IKVAV表现出加性协同作用。此外，RGD和IKVAV可混合用于心脏组织工程，IKVAV和YIGSR可混合用于神经发生，RGDS与磷酸丝氨酸可混合用于骨再生研究。
b. 细胞粘附和生长因子结合表位的混合物
细胞粘附肽也可以与生长因子结合表位结合；例如，聚丙烯酸酯可以通过在聚丙烯酸酯单体的甲基上吸附和组装蛋白质来展开纤维连接蛋白，从而引起纤维连接蛋白的构象变化并暴露其表位（FNIII9-10和FNIII12-14），从而实现协同粘附和生长因子信号传导73。重组纤维连接蛋白功能化的3D纤维蛋白水凝胶含有两个生物活性片段（FNIII9-10和FNIII12-14），可以装载VEGF促进糖尿病小鼠伤口愈合。同样的平台可以加载BMP-2用于骨缺损的骨再生。含有全长纤维连接蛋白的聚乙二醇水凝胶具有可调节的物理特性，可以保留BMP-2和VEGF，以帮助体内骨再生和血管形成。rad16 - 1可以与纤维连接蛋白和层粘连蛋白衍生基序以及肝素结合序列TAGSCLRKFSTM结合培养肝细胞。此外，可以利用rada16 - 1设计合成干细胞壁龛，rada16 - 1被SKPPGTSS（骨髓归巢基序）、FHRRIKA（肝素结合基序）和PRGDSGYRGDS（双单元RGDS细胞粘附基序）功能化。此外，RADA16水凝胶可以用RGD和vegf来源的表位修饰以促进牙本质-牙髓再生，EAK16-II水凝胶可以用纤维连接蛋白的RGD和（GRGDSP）4K、玻璃体连接蛋白的FRHRNRKGY、层粘连蛋白的IKVAV和IGF-1功能化，用于神经组织工程。同样，含有bdnf模拟基序和IKVAV序列的水凝胶可以作为中空壳聚糖管的填充物来桥接大鼠10毫米长的坐骨神经缺损，从而实现周围神经再生。也可以采用多表位方法来刺激成骨和骨形成；例如，含有REDV、RGDS和statherin衍生肽DDDEEKFLRRIGRFG的elp基膜分别改善内皮化、细胞粘附和磷酸钙结合，从而增加体外成骨细胞分化和临界尺寸大鼠颅骨缺损模型中的骨沉积。同样，在与内皮细胞和MSCs共培养中，共组装PA水凝胶（包括用于细胞粘附的RGDS、用于血管生成的SVVYGLR和用于成骨细胞分化的DGEA）促进骨球体的生长
c. 多种生长因子模拟表位的混合物
表明多种生长因子的表位可以整合在同一水凝胶中；例如，CTDIKGKCTGACDGKQC（模拟NGF）和RGIDKRHWNSQ（模拟BDNF）肽组合可作为神经导管填充剂，协同促进大鼠10mm坐骨神经缺损周围神经再生。类似地，模拟bdnf的肽可以与模拟vegf的基序在基于rada16的水凝胶中结合，以促进周围神经再生，并在大鼠的坐骨神经间隙中桥接。除了血管生成特性外，VEGF还具有神经营养和神经保护作用。因此，在BDNF/ vegf功能化的水凝胶上培养的大鼠雪旺细胞表现出粘附、扩散和髓鞘化的标记物。此外，功能化水凝胶还能诱导有髓鞘纤维的萌发、轴突的再生和活体运动功能的恢复
d. 细胞粘附、模拟生长因子和酶可切割表位的混合物
基质动态、细胞粘附和生长因子信号也可以在同一系统内实现。例如，多结构域肽系统“SLanc”包含细胞粘附序列RGDS、一种MMP-2敏感肽和一种vegf模拟肽。大鼠皮下注射slac水凝胶可在7天内促进种植体周围形成大量血管，宿主细胞浸润迅速，纤维包埋不足84。RGD还可以在水凝胶载体中与mmp -2敏感肽序列结合，用于递送间充质干细胞，以增加间充质干细胞的附着和支架的细胞重塑。含有RGD和mmp -2敏感切割位点（TPGPQGIAGQ）的PA系统能够在细胞培养过程中实现组织模板的“自分离”，用于下游应用。一种3D PEG ecm启发的水凝胶，包含13个细胞粘附整合素结合肽和7个mmp可降解肽，旨在模拟人类骨髓中蛋白质的多样性。在这里，肽是通过基于蛋白质组学和生物力学的方法从天然组织中选择的。骨髓来源的粘附线索和可切割位点的特定组合重现了天然骨髓的体积模量，并为MSC生长和分化提供了仿生生态位。类似地，天然大脑中含有九种整合素结合肽和五种mmp可降解肽的聚乙二醇基水凝胶能够以最小的激活在体外控制和维持星形胶质细胞的静止。
参考文献：www.nature.com/articles/s44222-023-00055-3
