pH（Low）插入肽（pHLIP）家族是一种与肿瘤无关的技术，它利用肿瘤微环境（TME）内细胞表面的低pH值（或高酸度）作为靶向生物标志物。pHLIP可用于细胞外和细胞内递送各种成像和治疗有效载荷。与针对特定细胞表面受体的治疗递送不同，pHLIP可同时靶向癌细胞、基质细胞和某些免疫细胞。由于TME表现出复杂的细胞间相互作用，同时向不同细胞类型进行靶向递送可使许多药物产生显著的协同效应。
pHLIP还可定位在各种纳米颗粒（NPs）的表面，用于封装有效载荷的靶向细胞内递送。目前，pHLIP技术正在肿瘤成像和治疗的临床前和临床应用中不断推进。
在TME内，高度增殖的癌细胞、肿瘤基质和活化的免疫细胞为了应对高能量需求，往往采用增强的糖酵解，无论在有氧条件下（Warburg效应）还是在缺氧条件下（Pasteur效应）都会显著酸化细胞外空间。此外，位于基质旁边的一些癌细胞，主要由癌相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、髓来源抑制细胞（mMDSCs）和调节性Treg细胞组成，可以消耗乳酸和其他代谢物以促进氧化磷酸化（OXPHOS），这种现象被称为反向Warburg效应。
pHLIPs是一类中等亲水性肽，具有对细胞质膜的中等亲和力，正常pH值下，当它们位于细胞表面时，会响应表面的pH值surf，如果pH值是酸性的，它们会插入到膜中形成稳定的跨膜（TM）螺旋，通常C末端位于细胞质中，N末端保持在细胞外空间（图1)。肽的插入端上的任何质子化的羧基在跨膜运输过程中以中性形式被转移到细胞质中。由于细胞质中的pH值接近中性；去质子化羧基发生电离，它们带上负电荷。这些电荷帮助pHLIP肽在膜中作为锚，显著降低了pHLIP从细胞膜中的退出率。
当 pHLIP 肽插入细胞膜时，它会贯穿膜脂双层，将一端（通常是 N 端）置于细胞外空间，另一端（通常是 C 端）置于细胞内空间，从而为通过与任一端连接实现向细胞膜外表面或内表面的靶向递送货物创造了机会。成像和免疫激活剂可通过不可裂解的连接物连接，或与 pHLIP 一起表达为融合蛋白，以实现细胞外递送（图 2）。需要注意的是，细胞最终会通过胞吞作用摄取这些细胞外递送的负载物。这种细胞内摄取对大多数成像应用没有影响，但可能会限制免疫刺激剂的免疫激活功能。靶向细胞表面递送提供了广泛的应用。
pHLIP作用的分子机制【文献1】
利用单色氨酸 pHLIP 变体对 pH 触发的膜相关折叠机制进行了详细研究，这使得能够追踪肽的不同部分在膜脂双层中的插入和穿膜过程，该过程与螺旋-卷曲转变相关。研究表明，随着肽在疏水区域的深入分布，平衡从卷曲结构向螺旋结构偏移（图 1）。膜插入的活化能垒随着肽序列中可质子化基团数量的增加以及肽膜插入端存在极性或带电荷的负载而显著增加（数量级）。此外，膜脂质组成和离子的存在已被证明会调节膜相关折叠。对原始野生型 pHLIP 的序列进行了变化，并设计和研究了一组 pHLIP 肽。尽管存在其他因素的有趣影响，但很明显，位于肽的膜插入跨膜区和相邻序列中的天冬氨酸和谷氨酸残基或其非典型类似物的质子化，在 pH 触发的膜相关折叠/解折叠过程中发挥着关键作用。
这些质子化/去质子化事件界定了 pHLIP 技术的生物医学相关性和应用。膜插入的 pKa 由单个羧基质子化的 pKa 决定，并且随着肽向脂质双层疏水核心的推进，由于介电常数降低，其 pKa 向更高 pH 值移动，在那里水稀缺。不同序列的 pHLIP 肽，无论是否在肽链的一端或两端连接有效载荷，在状态 II（在中性或高 pH 值时吸附在膜上）下可能具有非常不同的构象和双层亲和力，从松散结合且主要无序到部分折叠并更深入地嵌入双层。然而，在大多数情况下，由于主链氢键的形成，pHLIPs（状态 III）的膜插入状态是相似的，这导致了相似的螺旋骨架构象。
由于不同 pHLIPs 在折叠途径（或膜相关卷曲-螺旋转变）中的起始位置不同，其热力学和动力学参数可能会有很大差异。一些研究者在特定 pHLIP 肽的折叠途径中观察到了中间状态。中间状态的存在和可观察性在很大程度上取决于许多变量，包括 pHLIP 的序列、脂质组成、双层不对称性、离子强度以及任何有效载荷的性质。然而，具有最少可质子化基团和截短的膜插入端的 pHLIP 肽在膜插入和螺旋形成方面表现出明显的全有或全无转变。通过采用统计物理学的方法，构建了高 pH 和低 pH 下 pHLIP 在膜中的自由能景观，描述了 pHLIP 的状态。
有两个观点似乎至关重要：首先，应始终考虑不同状态的统计集合，这样所观察到的是主要子集而非单一状态；其次，在具有恒定且快速血液流动的体内应用系统中，动力学尤为重要。从临床角度来看，重要的变量是那些能调节临床先导化合物在细胞中行为的变量，而细胞中复杂的不对称膜、pH 梯度和成分环境所构成的舞台是简单的模型系统所无法体现的。
在肿瘤中，这种复杂性更大，还存在由细胞间相互作用以及动物宿主的影响所带来的额外变量。因此，简单系统中的观察结果可作为有用的指导，但不能完全定义 pHLIP 临床应用所需的选择。
