小肽作为人类癌症靶向药物，已成为单克隆抗体（mAbs）极具吸引力的替代品，因为它们具有独特的优势组合，使其成为治疗应用的有希望的候选药物。小肽结合了小分子（如口服生物利用度和高膜通透性）和蛋白质（如靶点特异性、高作用效力以及相对较少的脱靶副作用）的优点，是一个极具吸引力的选择。

在过去的几十年里，肿瘤靶向肽（TTPs）已成为靶向癌症治疗中颇具吸引力的工具。由于其分子量较低，肽的生产比单克隆抗体（mAbs）更容易且成本更低。TTPs 的独特性质，如低免疫原性、易于修饰、高肿瘤渗透性、肿瘤归巢能力和低骨髓蓄积，突显了其作为开发靶向药物递送系统以及癌症治疗分子成像探针的有前景的构建模块的潜力。为此，固相肽合成法作为一种高效技术应运而生，仅需中等反应条件。该方法能够直接生产具有明确功能的肽，展现出诸如受体识别、细胞通路激活或抑制等特定生物活性。在癌症治疗中，肽可以直接用作药物，也可以作为成像剂和细胞毒性化合物向肿瘤组织递送的载体。在这种情况下，细胞毒性药物与特定的肿瘤归巢肽结合，旨在降低化合物的脱靶毒性，并在靶点处实现更高的浓度。含药共轭物的一个重要特点是抗肿瘤药物在靶点处能被引导并容易从共轭物中释放出来，从而实现对肿瘤生长的有效抑制。为此，在药物和肽之间插入 pH 敏感或可被酶切割的连接子对于共轭物的循环时间和靶点处的药物释放起着关键作用。在过去十年中，针对 HER2 的各种肽靶向剂有了大量的发现和报道。

方巧军等人基于 HER2 与其亲和体 Z(HER2:342) 之间的相互作用展开了一项研究，从而鉴定出 2 种含 27 个氨基酸残基的新型肽，分别为 pep27（NKFNKGMRGYWGALGGGNGKRGIRGYD）和 pep27-24M（NKFNKGMRGYWGALGGGNGKRGIMGYD）。这两种肽均表现出对 HER2 的高亲和力和特异性。ZHER2 是一种由 58 个氨基酸组成的亲和体，其结构稳定，由螺旋 1（Asn6-Leu18）、螺旋 2（Asn24-Asp36）和螺旋 3（Ala42-Gln55）组成（图 4）。HER2/ZHER2 复合物的晶体结构（PDB ID：3MZW）显示，ZHER2 与 HER2 的结合位点不同，与 HER2 抗体（曲妥珠单抗和帕妥珠单抗）相比具有不同的特性。

ZHER2 对于开发成像剂或作为载体将药物导向 HER2 目标很有用。通过结合分子动力学（MD）建模、MM/GBSA 结合自由能计算以及结合自由能分解分析，研究了 HER2 与两个短肽 pep27 和 pep27-24M 之间的相互作用。该研究表明，pep27 和 pep27-24M 这两种肽均能以高亲和力与 HER2 蛋白的胞外域结合，其解离常数（KD）分别为 346 和 293 纳摩尔/升。体内和体外肿瘤荧光成像显示，pep27 和 pep27-24M 这两种肽对 HER2 阳性肿瘤具有很强的亲和力和特异性。此外，通过 MTT 检测，即使在高浓度（50 - 100 微摩尔/升）下，这两种肽对 SKBR3（HER2 高表达）乳腺癌细胞也没有显著的细胞毒性.

在后续的一项研究中，同一研究小组又鉴定出了另外四种肽序列：P51、P25、P47 和 P40。这些肽对 HER2 蛋白具有高亲和力，使其成为 HER2 阳性乳腺癌成像和靶向药物递送应用的有前景的工具。针对 HER2 受体筛选这些肽的过程涉及设计一个 OBOC（计算机辅助一珠一化合物）肽库，并结合原位单珠测序微阵列方法。结果，共鉴定出 72 种肽，其中 4 种肽尤其突出，即结合自由能最低的 2 种肽（P51：CDTFPYLGWWNPNEYRY 和 P25：CKTIYYLGYYNPNEYRY）以及结合自由能最高的 2 种肽（P47：CDYIPYLAYYNPNTYFQ 和 P40：CKKIPPLGWWNPNTWRY），通过表面等离子体共振成像（SPRi）方法对其进行了合成和分析，以确定它们与 HER2 的结合亲和力。SPRi 分析结果表明，这四种肽对 HER2 蛋白均具有高亲和力，其中 P51 的亲和力最佳，其 KD 值低至 18.6 纳摩尔/升。通过流式细胞术分析，对经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的肽 P51 和 P25 处理过的 HER2 阳性的人乳腺癌细胞系 SKBR3 以及 HER2 阴性的人胚肾细胞系 293A 进行了体外检测，证实了肽 P51 和 P25 对 HER2 阳性细胞具有高亲和力和特异性。此外，对 HER2 阳性的 SKBR3 细胞和 HER1 阳性但 HER2 阴性的 468 细胞进行共聚焦荧光成像分析，进一步提供了肽选择性靶向的证据。另外，体内和体外成像结果与体外发现一致，证实了 P51 和 P25 肽能够有效靶向 HER2 阳性肿瘤。

在这项研究中，作者观察到当使用经 P51 和 P25 肽修饰的载有阿霉素（DOX）的脂质体纳米颗粒时，对 HER2 阳性细胞的细胞毒性增强。这一发现表明这些肽能够成功用于癌症治疗的靶向药物递送。用载有阿霉素的脂质体（含肽 P51-LS-DOX 和 P25-LS-DOX 或不含肽 LS-DOX）处理 SKBR3 细胞的共聚焦显微镜图像显示，肽的靶向作用在结合的早期阶段（5 分钟内）就已发生。此外，对用 P51 和 P25 修饰的载有阿霉素的脂质体处理的 SKBR3 细胞进行 MTT 细胞活力测定表明，当阿霉素浓度超过 50 μg/mL 时，靶向脂质体 P25-LS-DOX 和 P51-LS-DOX 的细胞毒性显著高于非靶向脂质体 LS-DOX。这表明肽修饰的脂质体的内吞作用很可能是通过受体介导和非特异性摄取进行的，而 LS-DOX 脂质体仅通过非特异性途径进入细胞。

在最近的一项研究中，海钱等人在探究曲妥珠单抗抗体与 HER2 蛋白的结合模式时，设计并合成了一个环肽 Cyclo-GCGPep1，该环肽对 HER2 具有良好的亲和力，能够通过肽-药物偶联物（PDC）将喜树碱特异性靶向至 HER2 阳性细胞。作者首先确定了一个包含 10 个残基（RIYPTNGYTR）的先导序列 Leadpep，该序列对于曲妥珠单抗与 HER2 蛋白的相互作用至关重要。接下来，研究人员系统地将 Leadpep 序列中的每个残基替换为其他天然氨基酸，并通过计算机模拟分析，通过计算突变能量来评估对结合亲和力的影响。结果，他们确定了五个具有三重突变的肽，其突变能量最低，并将其选为靶向 HER2 蛋白的潜在候选物（表 1）。在这些肽中，Pep1 与 HER2 蛋白的结合亲和力最佳，这一点通过表面等离子共振（SPR）实验得到证实，该实验测得的 Kd（解离常数）值为 7.595 μM。

表1 五个潜在的 HER2 靶向肽序列。

为了在肽中引入构象限制并提高其稳定性，将甘氨酸 - 半胱氨酸 - 甘氨酸（GCG）序列整合到 Pep1 链中，从而对 Pep1 序列进行环化，这是后续药物偶联所必需的。所获得的环肽 Cyclo-GCGPep1 与线性 Pep1 相比，其 Kd 值更小（2.555 μM），表明其结合亲和力更高，因此可能具有更强的 HER2 靶向能力。因此，通过在半胱氨酸残基与喜树碱之间形成二硫键，将 Cyclo-GCGPep1 用于开发肽 - 喜树碱偶联物。在合成的偶联物中，偶联物 1（图 5）对 SK-BR-3 和 NCI-N87 细胞表现出最强的抗增殖活性。此外，它还显示出对 HER2 阳性细胞的出色特异性递送能力，以及比单独使用喜树碱更好的渗透性。这些有希望的结果表明，偶联物 1 代表了治疗 HER2 阳性癌症的一种有前景的治疗选择。

图 5. camptothecin的结构（a）和缀合物 I（环 - GCGPep1 - camptothecin）的结构（b）。

另一组研究人员利用单克隆抗体曲妥珠单抗（Fab）通过计算方法研究了这些配体与 HER2-DIVMP（HER2 第四结构域模拟肽）之间的相互作用，从而设计出专门针对 HER2 受体的肽配体。通过受体片段法，采用荧光光谱法和表面等离子体共振（SPR）技术对所选配体与受体片段 HER2-DIVMP 之间的结合实验进行了研究。在所研究的肽中，从曲妥珠单抗 Fab 重链中筛选出的低分子量肽 A9（Ac-Q27-D28-V29-N30-T31-A32-V33-A34-W35-NH2）显示出低纳摩尔范围的解离常数；此外，对 A9 与受体模型之间的分子相互作用进行的进一步结构研究（计算方法和核磁共振验证）证实了 A9 对 HER2-DIVMP 的高结合亲和力。因此，A9 肽配体被选为开发 HER2 特异性放射性探针的合适候选物。为此，通过酰胺键将 A9 的 N 端与无环螯合剂 DTPA（二乙三胺五乙酸）连接，随后用 111In 进行放射性标记；因此，对 111In-DTPA-A9 共轭物与 HER2 阳性的人类乳腺癌 BT474 细胞的亲和力进行了研究。放射性探针显示出对 HER2 过表达癌细胞具有高度的靶向特异性（KD = 4.9 nM）。此外，111In-DTPA-A9 在正常小鼠体内的生物分布数据表明，它不会显著结合健康器官和组织。所收集的数据证实了 A9 肽能够以高亲和力靶向 HER2 受体，为将此肽用作分子成像诊断和抗癌药物主动靶向的有前景的探针铺平了道路。

为解决耐药性问题，川上幸二等人开发了一种新型分子靶向药物，即所谓的“杂交肽”，它由靶向结合肽和富含阳离子氨基酸残基的裂解肽组成，裂解肽可破坏细胞膜，通过膜裂解诱导癌细胞死亡。2013 年，同一研究小组基于这种杂交系统，将先前鉴定出的 HER2 结合肽序列与裂解肽相结合，开发了一种新的 HER2 靶向肽，称为 HER2 裂解杂交肽，并对其体内外细胞毒性活性进行了研究。HER2 裂解杂交肽由两个功能域组成，即 HER2 靶向肽 KCCYSL 和裂解肽 KLLLKLLKKLLKLLKKK（加粗和下划线的字母表示 D-氨基酸），二者连接形成杂交肽 KCCYSLGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK，能够与 HER2 结合并通过裂解引发细胞死亡。HER2 裂解杂交肽在 13 种细胞系（1 种卵巢癌、10 种乳腺癌和 2 种正常细胞）中进行了测试。该研究结果表明，这种肽能特异性结合 HER2 并选择性杀死 HER2 过度表达的癌细胞，包括曲妥珠单抗和/或拉帕替尼耐药的 MDA-MB-453 和 MDA-MB-361 细胞，但对正常细胞无害，并且能抑制 HER2 信号传导。在小鼠 BT-474 和 MDA-MB-453 异种移植瘤模型中评估了 HER2 裂解肽的抗肿瘤活性。体内研究结果表明，HER2 裂解杂交肽在 3 毫克/千克剂量下显著抑制肿瘤进展。

最近，Hosseinimehr S.J. 及其同事 开发了一种基于肽的新型 68Ga-PET 放射性示踪剂（68Ga-DOTA-(Ser)3-LTVSPWY），用于检测癌症中的 HER-2。多年来，不同的靶向配体，如抗体、纳米抗体、小支架蛋白和肽，已与各种放射性同位素（18F、124I、44Sc、89Zr、64Cu 和 68Ga）结合，以获得用于成像 HER2 阳性肿瘤的 PET 放射性示踪剂。与蛋白质和抗体等大分子相比，小肽在成像剂的开发方面具有许多优势特性。这些优势包括更高的组织渗透性和更快的血液循环时间，从而在使用放射性肽成像 HER2 表达肿瘤时能更快地完成成像。

图 6. 68Ga-DOTA-(Ser)3-LTVSPWY 肽的化学结构。肽（LTVSPWY）通过由三个丝氨酸残基（(Ser)3）（蓝色）组成的间隔基与含放射性核素（68Ga）的 DOTA 配体（橙色）相连接。

该成像剂 68Ga-DOTA-(Ser)3-LTVSPWY 由通过三个丝氨酸氨基酸残基间隔的 HER2 靶向肽 LTVSPWY 与标记有 68Ga 放射性核素的双功能螯合剂 DOTA 偶联而成。在体外，68Ga-DOTA-(Ser)3-LTVSPWY 在 HER2 阳性的人卵巢癌细胞系 SKOV-3a 中进行了评估。随后的体内研究包括在携带 SKOV-3 异种移植瘤的小鼠中进行的生物分布和成像分析。所开发的 PET（正电子发射断层扫描）成像探针在低纳摩尔范围内表现出良好的稳定性和对 HER2 受体的特异性结合；此外，68Ga-DOTA-(Ser)3-LTVSPWY 在 HER2 表达的异种移植瘤中显示出特异性肿瘤积聚和高对比度成像。

奎因等人首次发现的 KCCYSL 肽以及含有 KCCYSL 序列的肽，也特异性地靶向 HER2 受体。这些用 111In 和 64Cu 标记的肽在众多体外和体内研究中都得到了评估。

加博尔·梅佐等人选择此肽作为起始序列，以获得能够与 HER2 过表达的乳腺癌细胞高亲和力和高特异性结合的新修饰肽。他们将修饰后的 KCCYSL 序列与从计算机辅助的“一珠一化合物”（OBOC）肽库中选取的 GYYNPN 肽相结合，从而得到靶向 HER2 胞外区域的肽类似物，并比较了它们与 HER2 表达细胞的结合情况。通过固相肽合成法合成了六肽和十二肽的肽类似物（表 2）。在最后一步，将荧光染料 5(6)-羧基荧光素（CF）连接到肽链的 N 端残基上（表 2）。

表2 HER2 结合肽序列。

通过流式细胞术和共聚焦显微镜，利用 HER2 过表达的 MDAMB-453 乳腺癌细胞对其细胞外定位和特异性进行了测定和确认。基于细胞与 CF 标记肽孵育后所测得的荧光强度，对六肽 KCCYSL 的氨基酸序列变化进行了研究。在该组中显示出最高摄取率的最佳类似物 P(SC) 和 P(AA) 被选中用于组合肽的设计。在细胞摄取研究中，最有前景的组合肽 cP(AA)_P(YY) 显示出比六肽 P(AA) 高十倍的荧光强度值。此外，在 MDA-MB-453 细胞膜上检测到了这些肽，表明它们与 HER2 的细胞外结构域结合。对显示出最高细胞摄取率的肽 cP(AA)_P(YY) 和 cP(SC)_P(YY) 的特异性进行了监测，方法是在加入 CF 标记衍生物之前先用未标记的肽预孵育细胞。流式细胞术的结果表明荧光信号减弱，这表明未标记的肽与细胞表面的特异性受体结合，抑制了 CF 标记肽的结合。还通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析了最佳组合肽 cP(AA)_P(YY) 的反向版本 cP(YY)_(P(AA))。所获得的结果证实了两个肽的顺序的重要性，因为反向肽 cP(YY)_(P(AA)) 与细胞的结合程度要低得多。通过修改和组合两组已知的 HER2 结合肽，开发出了一种 12 个氨基酸的肽，它能以高亲和力和特异性结合 HER2 过表达的细胞，可用于癌症诊断和药物靶向。

基于肽的疗法为癌症的诊断和治疗提供了很有前景的途径。然而，必须承认其存在的局限性和挑战。尽管肽具有巨大的潜力，但它们可能会遇到诸如稳定性问题、易受酶降解以及由于其大小和疏水性而导致的膜通透性差等问题。它们在血浆中的循环半衰期短以及在体内快速清除，进一步影响了其疗效。

这些内在特性常常限制其只能通过静脉给药途径进行施用，从而影响患者的依从性。为了克服这些局限性，涉及肽修饰以及与稳定剂结合的策略逐渐成为增强肽稳定性的可行方案。解决肽的生物分布难题同样至关重要，因为其结构的灵活性可能导致脱靶相互作用并引发不良副作用。

因此，人们探索了不同的化学策略来优化肽的设计，重点在于提高二级结构的稳定性以及整体的生物利用度。这些技术包括氨基酸替换（D-或β-氨基酸）、环化、N-甲基化、聚乙二醇化、脂化以及通过“钉合”来稳定α-螺旋结构。

另一个值得关注的方面是合成肽有可能在体内引发免疫反应。这种免疫反应会降低治疗效果，并可能导致潜在的不良影响，因此需要谨慎修改以减轻这些挑战。

此外，有必要强调经济方面，因为合成和提纯这些肽的复杂过程可能既费力又耗时，而且成本高昂。确保可重复性、可扩展性和产品质量对于成功实现临床转化至关重要。

目标细胞产生抗性或适应性的风险，尤其是在癌症治疗的背景下，突显了联合疗法或开发创新靶向方法的重要性。此外，组织渗透和细胞内递送方面的挑战可以通过使用纳米粒子等创新递送系统来缓解。

参考文献：doi.org/10.3390/nano13172476