羟基磷灰石（HA）结合肽因其对矿化组织的高亲和力而在骨靶向治疗中具有巨大潜力。然而，大多数现有研究主要集中在体外结合特性上，对于其体内生物分布和骨结合性能的了解有限。在本研究中，我们使用荧光成像评估了四种 HA 结合肽（D8、E8、YD8 和 YE8）在健康和病理骨环境中的体内行为，以评估其生物分布情况。在健康动物中，D8 表现出最强的骨结合能力，在颅骨、股骨和胫骨中均有显著定位，而 YD8 则表现出中等结合能力。E8 和 YE8 的定位则较为有限，受肽剂量和结合动力学的影响。在包括胫骨缺损和成骨不全（OIM）小鼠在内的病理模型中，D8 和 YD8 优先在受损骨区域积聚，突显了它们在靶向疾病骨微环境方面的潜在用途。荧光成像结合光谱解混算法能够有效地可视化和量化肽的定位和分布情况。这些发现突显了体内研究对于推进透明质酸结合肽在治疗和诊断应用方面的价值。研究结果为优化肽的设计以提高其在骨修复和再生中的特异性和有效性奠定了基础。

由于先前的研究表明，四种合成肽（分别简称为 D8、E8、YD8 和 YE8）对骨的关键成分羟基磷灰石（HA）具有很强的亲和力，因此选用了这四种肽。ζ 电位分析表明，D8、YD8 和 E8 具有中等程度的负表面电荷（>-10 mV），而 YE8 则表现出最负的 ζ 电位（-11.4 ± 3.4 mV），这可能是由于其酸性残基含量较高所致。表面电荷在肽的生物分布、循环时间和与血液蛋白及组织的相互作用中起着至关重要的作用。与带正电荷的肽相比，带负电荷的肽可能通过与 HA 中带正电荷的钙离子发生静电相互作用而增强骨亲和力，并且具有更长的循环时间，而带正电荷的肽则更易发生非特异性结合和更快的清除。

肽的体外结合能力在羟基磷灰石（HA）、瞬时钙磷灰石（TCAP）和碳酸钙（CaCO₃）上进行了测试，这些是参与骨组成和重塑的关键含钙成分。羟基磷灰石是骨骼和牙齿的主要矿物质成分，占骨骼重量的 60% 至 70%。它为骨骼提供结构强度和刚度，并在骨重塑过程中发挥关键作用。瞬时钙磷灰石是骨形成过程中结晶为羟基磷灰石的瞬时矿物质相，在骨发育中起着中间作用。碳酸钙虽然不是骨骼的主要成分，但可作为 pH 缓冲剂，并且可能在软组织中导致病理性钙化。这些差异为评估肽与生理和病理含钙材料的相互作用提供了基础。

体外测试表明，所有肽在 24 小时内均迅速结合，其中 D8 表现出最强且最持久的结合力，在五天内持续稳定上升。这些发现再次证实了 D8 适合在矿化表面上长期保留，这在相关研究中已有过证明。相比之下，YD8、E8 和 YE8 在 1 至 3 天达到峰值后略有下降，这可能是由于部分解离或平衡动力学所致。在所有基质中，羟基磷灰石（HA）表现出最高的结合效率，这反映了其结构化的表面以及作为主要骨矿物质的兼容性，而碳酸钙（CaCO₃）的结合力最弱，这可能是由于其结晶度较低。这些发现证实了羟基磷灰石在骨靶向研究中的相关性，并突出了基质特异性肽行为对于治疗开发的重要性。

虽然体外结合试验能为肽与骨矿物质的亲和力提供初步见解，但体内评估能更深入地了解它们在生理环境中的表现。通过静脉给药和体外荧光成像，我们分析了肽在骨组织中的定位以及对软组织的潜在非特异性黏附。在健康大鼠中，荧光成像显示，肽在矿化组织（如颅骨、脊柱、股骨和胫骨）中的定位明显强于软组织，这证实了它们对骨组织的特异性。在测试的肽中，D8 显示出最强的骨结合能力，其次是 YD8，而 E8 和 YE8 的定位则较为温和。

我们还发现，尽管荧光成像为肽结合和生物分布提供了有价值的见解，但由于组织自发荧光的影响，其在量化结合亲和力和检测细微的相互作用差异方面存在局限性。为解决这一问题，我们应用了 SPUM 算法，该算法能有效地将荧光信号与重叠的自发荧光区分开来。光谱解混是一种计算方法，通过线性分解组合光谱数据，根据各荧光团的参考发射光谱将其贡献分离出来，从而分离重叠的荧光信号。它能够精确区分多种荧光团，并减少可能具有显著光谱重叠的样本中的串扰，这在可见光谱或使用 FITC 荧光团时尤其有利。这种方法提高了分析的准确性和清晰度，能够精确地可视化并可靠地量化肽的生物分布和结合效率。

利用 SPUM 技术，我们比较了健康胫骨和有缺陷胫骨中肽的生物分布情况，发现两者存在明显差异。在健康的胫骨中，肽在骨内分布均匀，这反映了其完整的微结构。相比之下，有缺陷的胫骨中肽在缺陷周围的区域聚集明显，而非在缺陷内部，这表明在缺乏或矿化不均的受损骨环境中，肽的结合动力学发生了改变。为了进一步细化这一分析，我们使用了 LivingImage® 软件中的 ROI 工具包，并结合网格分割技术来提取高分辨率的荧光强度。这种方法能够进行更高级的分析，包括基于阈值的定量分析和热图生成，从而为肽的分布提供详细的见解。结果表明，D8 和 YD8 肽在缺陷区域周围的聚集程度明显高于健康骨，不过可能还需要进一步改进肽的结构，以提高其在矿化程度较低区域的渗透和滞留能力。这些发现再次证实了这些肽对受损骨环境具有很强的亲和力，同时也表明需要进行优化以增强在期望区域内的靶向性。

总之，本研究利用 IVIS Spectrum CT 系统的荧光成像技术，并借助 LivingImage® 软件包进行分析，为肽类生物分布提供了新的体内见解，并对肽类定位进行了量化。在健康和有缺陷的胫骨以及 OIM 小鼠模型中进行的实验证实了 D8 对骨组织具有很强的亲和力，并验证了基于 IVIS 的定量方法是评估肽类分布的可靠工具。在图像处理过程中使用 SPUM 算法，我们的研究结果还突出了肽类在股骨、胫骨、颅骨和脊柱中的区域差异积累，强调在设计靶向递送系统时需要考虑骨组织的异质性。诸如不均匀矿化和钙化受损等结构异常显著影响了肽类在整个组织中的定位，这突显了根据特定骨组织特征调整肽类疗法的重要性。

尽管本研究为体内靶向分布特征及透明质酸结合肽的时效性保留提供了有价值的见解，但仍存在一些局限性。首先，诸如组织学分析、微计算机断层扫描或生物力学测试等功能性结果指标有意未纳入本研究范围。本研究的主要目标是通过表征肽在骨骼组织中的定位模式，包括起效时间、峰值和持久性，来建立药代动力学框架。若没有这一基础，对功能性结果的解读将因给药效率的不确定性而变得复杂。未来的研究将整合这些评估，以确定靶向积聚是否能转化为骨骼结构和机械性能的可测量改善。其次，本研究未进行剂量反应分析，这本可为肽的浓度依赖性效力和选择性提供更多信息。使用单一标准化剂量是为了能够直接比较并减少药代动力学的变异性，但这种方法可能会低估在该浓度下结合力较低的肽的性能。未来的研究工作将纳入系统的剂量反应研究，以明确肽剂量、结合效率和选择性之间的关系，特别是在病理骨模型和肽偶联递送系统中。第三，尽管此处报告的体内生物分布概况为 HA 结合寡肽的相对骨靶向性能提供了有价值的信息，但评估仅限于这一类配体，且未直接与其他已确立的骨靶向策略（如功能化纳米颗粒、双膦酸盐或抗体 - 药物偶联物）的性能进行比较。在未来的研究中扩大这些比较将有助于确定特定治疗或诊断应用的最佳策略。最后，由于选择了成本效益高且易于合成的 FITC 标记，成像仅限于可见光谱，无法使用近红外或短波红外荧光团进行实时追踪，而这些荧光团具有更深的组织穿透能力和更低的自发荧光。未来的研究将采用先进的荧光团，如 Cy5.5 或 Cy7，将比较范围扩大到更多的靶向模式，并探索剂量反应关系，以优化在健康和病理骨中的结合效率和选择性。

本研究对合成的羟基磷灰石（HA）结合肽进行了体内评估，证实了 D8 和 E8 等已确立候选肽的有效性，同时为 YD8 和 YE8 提供了新的见解。通过使用 IVIS Spectrum CT 系统和 SPUM 算法进行荧光成像，我们开发了可靠的方法来量化健康和病理骨模型（包括胫骨缺陷和骨质疏松性骨损伤小鼠模型）中肽的生物分布和定位。我们的研究结果证实了 D8 对骨的强亲和力，并突出了荧光成像在识别异常骨组织方面的潜力。未来的研究应通过增加时间点、改变剂量以及采用更多模型来进一步验证荧光成像在表征骨病理学和优化肽应用方面的有效性。这些结果加深了对 HA 结合肽和骨靶向治疗成像技术的理解，支持了肽设计和成像方法的优化，以促进骨修复和再生。

参考文献：doi.org/10.1007/s13346-025-01968-9