在癌症治疗中，基于抗体的靶向疗法面临挑战，因为抗体在实体瘤中的分布不均，阻碍了药物的有效递送。为解决这一问题，文章利用计算方法开发了对孤儿受体酪氨酸激酶样受体 1（ROR1）具有纳摩尔级亲和力的肽模拟物。这些肽在体外和体内均表现出特异性靶向和深度渗透。此外，文章通过将靶向肽与毒素药物连接，并利用脂肪侧链增强其与白蛋白的结合来延长其在体内的半衰期，从而制备了肽药物偶联物（PDCs）。抗肿瘤候选药物 II-3 显示出卓越的亲和力（KD = 1.72×10–9 M）、内吞效率、抗癌效力（IC50 = 0.015 ± 0.002 μM）和药代动力学特性（t1/2 = 2.6 小时），这表明设计具有良好组织分布和强肿瘤渗透性的 PDCs 的合理方法。
名称：PR7
单字母 H2N-SDINDRQIPGYSTYWGDF-NH2
多字母 H2N-Ser-Asp-Ile-Asn-Asp-Arg-Gln-Ile-Pro-Gly-Tyr-Ser-Thr-Tyr-Trp-Gly-Asp-Phe-NH2
氨基酸个数 18
分子式 C96H133N25O31
平均分子量(MW) 2133.23
为了构建具有小分子量、适当亲和力和强肿瘤深层渗透能力的特定肽，文章专注于肿瘤特异性靶点 ROR1，并改进计算设计策略以模拟母体抗体的抗原结合位点。因此，文章成功开发了几种具有显著亲和力（KD = 10–8～10–9 M）和 ROR1 阳性肿瘤特异性渗透能力的肽。随后，文章通过使用三种不同的连接子（可酶切酯键、不可酶切单硫醚键和可被组织蛋白酶 B 响应的缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）与对氨基苄氧基羰基（PABC）间隔基（Mc-Val-Cit–PABC））将 ROR1 靶向肽与抗癌药物（吉西他滨和阿霉素）偶联，对 ROR1 靶向肽进行了优化。此外，为了改善肽-药物偶联物（PDCs）的药代动力学特性，文章引入了脂肪酸链以促进与白蛋白的结合。文章的目标是确定一种针对 ROR1 阳性肿瘤的强效且选择性的抗肿瘤 PDC 候选药物。
通过表面等离子共振（SPR）测定的 PR1-PR8 肽段和 ROR1 单克隆抗体与偶联于芯片上的 ROR1 蛋白的结合亲和力。根据上述实验结果，PR2、PR3 和 PR7 被选为候选靶向肽以供进一步实验。
在结合特异性研究中，共聚焦显微镜图像显示，靶向肽和 ROR1 单克隆抗体均与 ROR1 阳性的 MDA-MB-231 细胞有特异性结合（图 4A）。它们对 ROR1 阴性的 MCF-7 细胞系的结合几乎可以忽略不计，如图 S2 所示。用 PR7 处理的细胞显示出明显更高的摄取和内化信号（图 4A）
采用双色高速双光子成像系统进行了 3D 肿瘤球体实验，以研究肽的渗透情况（图 4B）。该图清晰地表明，在 0.25 小时时，ROR1-mAb 的渗透距离优于其他肽。然而，在 0.5 小时时，PR7 的渗透率显著增加，并超过了 ROR1-mAb。到 1 小时时，PR7 和 ROR1-mAb 均达到了最大渗透率，接近 100%。定量图像分析证实了 PR7 相对于其他肽或 ROR1-mAb 的渗透优势。这一观察结果进一步支持了之前的讨论，即分子的亲和力与其渗透性并非直接成正比，亲和力极高的抗体分子具有受损的肿瘤渗透特性。球体实验为量化组织渗透提供了一个高通量、可控且稳健的环境。基于上述共定位和肿瘤球体渗透实验的结果，PR7 被选为首选的靶向肽以作进一步研究。
使用近红外荧光染料吲哚菁绿（ICG）与 PR7 偶联进行成像，评估了 PR7 的肿瘤靶向性，如方案 S1 所示。给药 0.5 小时后观察到荧光信号。如图 5A 所示，接受 ICG 治疗的小鼠肝脏摄取量更高，且在体内有非特异性分布。相比之下，接受 ICG-PR7 治疗的小鼠肿瘤组织中的荧光信号高于其他组。如图 5B、C 所示，ICG-PR7 处理组的肿瘤荧光显著高于游离生理盐水和 ICG 组，表明 PR7 具有更优的靶向能力。
在选择用于肽药物偶联物（PDCs）的细胞毒性药物时，必须满足四个关键标准：作用机制明确、分子量小、细胞毒性高以及与肽偶联后仍保持抗肿瘤活性。遵循这些设计原则，文章选择了吉西他滨（GEM）和阿霉素（DOX）作为靶向偶联物中的药物有效载荷。
在 PDC 设计中，连接子的选择也是一个关键方面，需要仔细考虑微环境，以保持肽的结合亲和力和药物疗效，同时避免药物过早或非特异性释放。可裂解和不可裂解连接子都具有独特的优势。在文章追求能够在循环中保持稳定并在靶细胞内有效释放毒素药物的 PDC 的过程中，文章设计了三种不同的连接子：酶可裂解酯键、不可裂解的单硫醚以及 Mc-Val-Cit-PABC
此外，线性肽类药物由于酶促水解和快速肾小球滤过作用，其作用时间有限，这限制了其应用和治疗效果。为了克服肽类药物半衰期短的难题，与白蛋白结合被认为是延长肽类药物短半衰期的最有效方法之一。在此，设计了一个位点用于连接脂肪酸链以与白蛋白结合。为了尽量减少对目标肽空间结构的影响，设计了两种偶联模式：一种是将司美格鲁肽侧链（C0，图 6A）通过巯基偶联，另一种是在 N 端直接偶联修饰后的司美格鲁肽侧链（C1，图 6B）
PDC具体实验可以查看原文，总之，化疗药物的靶向递送旨在通过将药物集中在作用部位来提高疗效并降低毒性。文章的方法旨在基于抗体与抗原接触的互补决定区（paratopes）将抗体缩小为小得多的肽模拟物，采用基于结构的设计和计算方法。这些肽模拟物在很大程度上保留了原始抗体的固有靶向特性，同时显著增强了渗透性。设计并合成了几种肽药物偶联物（PDCs），其中 II-3 表现出卓越的肿瘤归巢能力、增强的药代动力学特性以及在三阴性乳腺癌治疗中的巨大潜力，脱颖而出。文章的方法不仅克服了抗体药物偶联物（ADCs）渗透不足的局限性，还解决了肽药物偶联物（PDCs）靶向性不足的问题。这种方法为新型 PDCs 的设计提供了新的途径和方法。此外，文章的策略为高亲和力靶向肽的开发奠定了基础。除了毒素药物之外，这些靶向肽还可以与各种实体结合，例如放射性核素、免疫激动剂、寡核苷酸、降解剂、细菌外毒素等，从而有助于开发肽类药物偶联物。
参考文献：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c00511
