针对与疾病相关的活化中性粒细胞进行靶向药物递送能够提供新的治疗机会，同时避免对免疫功能产生全身性影响。文章创建了一个纳米医学平台，该平台独特地利用源自α1-抗胰蛋白酶的肽段，赋予纳米颗粒与活化中性粒细胞上的中性粒细胞弹性蛋白酶的结合特异性。体外和体内实验均表明，用这种肽段进行表面修饰能够使纳米颗粒特异性地锚定于活化中性粒细胞和血小板-中性粒细胞聚集体上。纳米颗粒递送模型药物羟氯喹在体外显著降低了中性粒细胞的活性，并在体内对小鼠静脉血栓形成产生了治疗效果。这种针对特定细胞和特定活化状态的创新靶向方法可应用于多种由中性粒细胞驱动的疾病。
为实现纳米颗粒对活化中性粒细胞及活化血小板的双重特异性靶向，作者系统筛选并验证了两类具有激活状态依赖性的细胞表面分子作为靶点：中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）和P-选择素（P-selectin）。NE在中性粒细胞活化过程中大量释放并暴露于细胞表面，而静息状态下几乎不表达于质膜，因而可作为区分中性粒细胞激活状态的理想标志物（图1a）；P-选择素则在血小板活化后由α颗粒迅速转位至质膜，是血小板活化的经典功能标志。针对NE，作者基于α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin, AAT）——一种天然、高亲和力的NE内源性抑制剂——的反应中心环序列，理性设计了一条14个氨基酸的NE结合肽（NEBP），序列为CGEAIPMSIPPEVK。
名称：NEBP
单字母 H2N-CGEAIPMSIPPEVK-OH
多字母 H2N-Cys-Gly-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-Pro-Glu-Val-Lys-OH
氨基酸个数 14
分子式 C64H107N15O20S2
平均分子量(MW) 1470.75
该设计保留甲硫氨酸（Met）作为P1位关键残基以维持与NE活性口袋的特异性识别，并在N端引入半胱氨酸残基（Cys）用于后续定点偶联至脂质纳米颗粒（lipid-based nanoparticles, NPs）（图1f）。结合表面等离子体共振（SPR）及酶联免疫吸附实验，作者证实NEBP对人源（hNE）及鼠源（mNE）弹性蛋白酶均表现出纳摩尔级亲和力与高度特异性。针对P-选择素，作者选用经噬菌体展示筛选获得的高亲和力肽配体DAEWVDVS，并在其C端引入半胱氨酸残基以实现可控偶联，由此构建P-选择素结合肽（PBP）（图1f）。综上，作者成功构建了两种具有明确分子机制支撑、激活状态特异且可工程化整合的靶向配体，分别精准识别活化中性粒细胞（via NE）与活化血小板（via P-selectin），为双靶向纳米递送系统奠定了关键基础（图1f）。
研究人员对NP 表面修饰进行了两种组合：
（1）将两种中性粒细胞特异性配体 NEBP 和源自抗 Ly6G 抗体的抗原结合片段（Fab）结合，形成异多价中性粒细胞靶向NPs（NT-NP）；
（2）将NEBP与PBP结合以产生同时结合活化的中性粒细胞-血小板聚集体的异多价 NPs（PNT-NPs）。
越来越多的证据揭示了中性粒细胞群体内部存在显著的表型异质性。从患有自身免疫性疾病、慢性感染和癌症的个体中分离出的中性粒细胞的功能表征发现了一个独特的亚群，该亚群表现出促炎性、活化的表型，具有延长的寿命和形成中性粒细胞外网（NETs）的倾向。在此背景下，文章旨在开发一种治疗策略，专门针对这些致病性中性粒细胞亚群，而不普遍抑制静息细胞。
在设计一种激活状态特异性的神经蛋白酶抑制剂（NP）时，文章选择以中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）为靶点，因为中性粒细胞的几种致病性、促炎功能（例如组织蛋白水解和中性粒细胞外网状结构形成）在一定程度上依赖于弹性蛋白酶。对人源蛋白的研究证实，NEBP 与人源 NE 有很强的亲和力，但不与蛋白酶 3（PR3）、组织蛋白酶 G 或非中性粒细胞蛋白酶结合。先前的研究表明，几种因素会影响丝氨酸蛋白酶抑制剂的行为，其中包括（1）反应中心环的长度，（2）反应中心环之外的次级结合位点，以及（3）反应中心环构象的分子内控制。上述情况表明，完整抗胰蛋白酶（AAT）的结合动力学和活性可能与反应中心环衍生肽（如 NEBP）并不完全相同。
据文章所知，这是首次展示对活化中性粒细胞的特异性靶向。其他纳米医学系统已报道了对中性粒细胞的特异性靶向；然而，其设计显示出可能与其它免疫细胞发生交叉反应的潜在风险。例如，靶向结晶片段（Fc）-γ受体也会对 B 淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞产生影响，而靶向清道夫受体则会对所有髓样细胞、树突状细胞和内皮细胞产生影响。尽管中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）可能并非所有中性粒细胞介导疾病中的病理生理驱动因素，但其细胞特异性表达、在活化中性粒细胞上的独特表面保留以及在中性粒细胞外网（NETs）中的存在已被广泛证实。这些特性赋予了 NE 独特的能力，使其能够作为“诱饵”，捕获靶向纳米颗粒（NPs）以实现局部药物递送。考虑到中性粒细胞的平均寿命约为 18.5 小时（参考文献），在稳态下纳米颗粒的半衰期应与此相当，以实现对致病细胞的有效靶向。尽管脂质体纳米颗粒的体内应用已被证明是安全的，但仍需进一步研究以更好地确定 NEBP-NPs 和 PNT-NPs 的药代动力学、消除和安全性特征。运输研究显示，只有在活化的中性粒细胞组中才能检测到 NEBP-NPs 的细胞内运动，这表明限制纳米颗粒内化的关键步骤是 NEBP 与人中性粒细胞弹性蛋白酶（hNE）的结合。这类似于人中性粒细胞弹性蛋白酶与酵母相互作用时所描述的“受体介导的内吞作用”过程。
最后，文章展示了载药 PNT-NPs49 的治疗概念验证研究。文章进一步阐明了机制，即羟氯喹能有效抑制中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞外网形成。虽然羟氯喹目前有口服制剂获批，但其全身使用与多种不良事件有关。本研究结果应为未来测试半衰期有限、治疗窗窄或组织渗透性降低的治疗药物的研究奠定基础。文章小组此前已表明，因子 XII 和尿激酶型纤溶酶原激活物受体轴可上调中性粒细胞功能，从而增强细胞迁移和中性粒细胞外网形成。抑制因子 XII 介导的效应，特别是针对中性粒细胞，可改善皮肤伤口愈合，并限制卵巢肿瘤的生长和扩散。在非无菌性炎症中，中性粒细胞的过度激活与严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 感染中的微血管血栓形成和组织损伤有关。因此，针对中性粒细胞的策略，专门用于治疗活化的细胞并解决持续的炎症，有可能成为一种安全且高效的方法，以中和由中性粒细胞驱动的有害病理效应，促进愈合并保持先天免疫或止血功能。
参考文献：doi.org/10.1038/s41565-022-01161-w
