今天分享，发表在《Cellular Oncology》的 《Development of a 177Lu-labeled EphA2-targeting cyclic peptide combined with an HPK1 inhibitor for synergistic anti-tumor effects》，了解一种¹⁷⁷Lu标记的靶向EphA2环状肽与HPK1抑制剂联用以产生协同抗肿瘤效应

研究目的

尽管基于¹⁷⁷Lu的放射治疗在癌症治疗领域已取得显著进展，但其对难治性冷肿瘤的疗效仍有限。靶向肽-放射性核素偶联物（PRCs）联合免疫疗法正成为提升抗肿瘤疗效的前景广阔诊疗策略。

研究方法

通过噬菌体筛选鉴定出环肽CEMJ4，并进一步与 DOTA 结合，分别用⁶⁸Ga进行诊断成像标记、用¹⁷⁷Lu进行癌症治疗标记。通过体外细胞实验、体内PET/CT成像及生物分布研究评估其药物开发潜力；此外，在B16F10荷瘤小鼠模型中评估了¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4与造血祖细胞激酶1抑制剂（HPK1i）联合应用的可行性，重点观察其抗肿瘤免疫反应及肿瘤生长抑制效果。

研究结果

CEMJ4对人促红细胞生成素分泌型肝细胞受体A2（EphA2；KD=0.3±0.2 µM）具有高亲和力——该靶点在多种实体瘤中过度表达。放射性标记的⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4能特异性结合表达EphA2的B16F10细胞及肿瘤模型，有效抑制肿瘤生长；值得注意的是，HPK1i可逆转¹⁷⁷Lu诱导的T细胞免疫毒性并改善T细胞功能异常。联合使用¹⁷⁷Lu-DOTACEMJ4与HPK1i可显著降低肿瘤负荷，并增加肿瘤浸润的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞及M1型巨噬细胞数量。

1.68Ga/177Lu- DOTA -CEMJ4的体外与体内特异性评估

 DOTA -CEMJ4分别用⁶⁸Ga进行放射性标记用于诊断成像，在37°C下于PBS或胎牛血清（FBS）中孵育两小时后，⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4的体外稳定性仍保持在99%以上，并且在注射两小时后采集的小鼠尿液或血液样本中均呈现稳定的单峰分布。⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu-DOTACEMJ4在体外和体内均表现出卓越的稳定性，这促使我们进一步评估CEMJ4在肿瘤动物模型中的药物开发潜力。

首先，作者评估了孵育后不同时间点（5、10、20、30、60、90和120分钟）时68Ga/177LuDOTA-CEMJ4的细胞摄取情况。结果表明，68Ga/177Lu- DOTA -CEMJ4特异性结合表达EphA2的B16F10细胞，而与EphA2阴性T细胞未检测到结合。此外，B16F10细胞对68Ga/177Lu标记化合物的摄取量随时间持续增加（图3A-B）。当使用过量非放射性标记肽（DOTACEMJ4）预阻断B16F10细胞后，示踪剂（68Ga/177Lu- DOTA -CEMJ4）的摄取量显著降低，且阻断组与未阻断组之间存在统计学显著差异（P<0.0001）（图3C），证实了CEMJ4在体外具有优异的靶向特异性。为进一步评估细胞结合亲和力，作者采用不同浓度的非放射性标记DOTACEMJ4进行了竞争结合实验。结果显示，68Ga- DOTA -CEMJ4和177Lu- DOTA -CEMJ4针对B16F10细胞的半最大抑制浓度（<|semi-maximal inhibitory concentration>）分别为314.1 nM和550.8 nM（图3D），该数值与结合能力高度吻合。通过表面等离子体共振（SPR）测定， DOTA -CEMJ4与人EphA2的亲和力为KD=0.16±0.05 µM

鉴于EphA2在多种恶性肿瘤中均呈现高表达，在建立本研究的肿瘤模型前，首先采用蛋白质印迹法检测了多种肿瘤细胞系（A2780、A375、LNCaP、MCF-7、SK-OV-3、B16F10）中的EphA2表达水平。结果显示，这六种肿瘤细胞系的EphA2表达水平各不相同，其中B16F10和A375细胞的表达量最高（图4A）。这一结论通过小鼠异种移植瘤的微PET/CT成像进一步证实：68Ga- DOTA -CEMJ4在B16F10（4.5% ID/g）和A375肿瘤模型（2.1% ID/g）中的积聚量均显著更高，充分证明了CEMJ4的体内特异性。与此同时，非肿瘤结合肽可通过肾脏途径被快速清除（图4B）。

2.177Lu-DOTACEMJ4体外抗肿瘤效应评估

为分析177Lu-DOTACEMJ4的体外抗肿瘤活性，作者采用 CCK -8法评估了其在不同浓度下对B16F10细胞的作用。与游离态177Lu相比，177Lu- DOTA -CEMJ4对B16F10细胞存活率表现出更强的抑制作用（半抑制浓度≥18.02 MBq/mL）（图5A、图S9）。随后，使用相当于1/4、1/2及全半抑制浓度的177Lu- DOTA -CEMJ4处理B16F10细胞24小时，并以 RPMI 1640培养基作为阴性对照；之后将细胞置于新鲜无药物培养基中继续培养13天。进一步通过体外实验评估177Lu-DOTACEMJ4的生物学效应，结果显示其可抑制细胞集落形成（图5B-C），并降低B16F10细胞的迁移和侵袭能力（图5F-I）。此外，通过 γ -H2AX染色（DNA损伤的敏感标志物）及凋亡分析，发现其抑制效果呈浓度依赖性增强。经177Lu-DOTACEMJ4处理的B16F10细胞中凋亡率显著升高（图5E和J）。这一结果与流式细胞术检测显示的PI+/Annexin+细胞比例显著增加相一致（图5D），表明177Lu诱导的DNA损伤引发了晚期细胞凋亡。

3.HPK1抑制剂可减轻177Lu- DOTA -CEMJ4在体外对T细胞活化的抑制作用

根据先前的研究报告，基于¹⁷⁷Lu的疗法在免疫反应方面是一把双刃剑。为评估放射性核素¹⁷⁷Lu的免疫调节作用，研究人员首先激活了初始脾脏T细胞，随后分别用不同剂量的¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4（1/4、1/2及全半抑制浓度，半抑制浓度=18.02 MBq/mL）处理这些细胞48小时。经激活后，初始T细胞通过从T细胞受体（TCR）向多种下游通路传递信号（包括激活MAP激酶和转录因子）而发生增殖。这一过程使T细胞能够执行关键功能。TME 内的免疫功能（如分泌IL-2、 IFN - γ 及其他参与抗肿瘤反应的细胞因子）均受到影响。由¹⁷⁷Lu诱导的磷酸化蛋白激酶B（AKT）及细胞外调节激酶1/2（ERK 1/2）的相对表达量呈剂量依赖性下降（图6A，图S10A）。鉴于HPK1是TCR信号通路的负调控因子，作者使用HPK1抑制剂以缓解T细胞耗竭并增强抗肿瘤免疫反应。正如预期，¹⁷⁷Lu对T细胞产生的抑制作用可被HPK1抑制剂所逆转（图6B，图S10B）。

与经抗CD3/CD28抗体刺激的初始T细胞相比，经抗CD3/CD28抗体联合177Lu- DOTA -CEMJ4处理的T细胞增殖能力显著降低（表现为[³H]-胸腺嘧啶掺入量低于对照组初始T细胞）（图6C）。值得注意的是，这种增殖抑制现象具有重要研究价值。当与HPK1抑制剂联用时，177Lu- DOTA -CEMJ4可部分逆转其效应。平行 ELISA 结果显示，在经抗CD3/CD28刺激后使用177Lu- DOTA -CEMJ4处理的初始T细胞中，IL-2和 IFN - γ 的产生显著降低（图6D-E），该现象同样可被HPK1抑制剂逆转。这些结果表明，177Lu可能以非靶向依赖的方式抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，而HPK1抑制剂可部分缓解此效应。

4.HPK1抑制剂与177Lu- DOTA -CEMJ4协同作用，可增强体内抗肿瘤疗效

为进一步验证177Lu-DOTACEMJ4在体内的抗肿瘤活性，作者采用皮下肿瘤模型评估其肿瘤抑制作用的剂量-反应关系。将20只荷瘤小鼠随机分为4组（每组n=5）：对照组（PBS）、低剂量组（3.7 MBq）、中剂量组（7.4 MBq）和高剂量组（14.8 MBq）。如图7A-B所示，使用高剂量177Lu- DOTA -CEMJ4（14.8 MBq）处理可显著抑制B16F10细胞异种移植瘤的生长，而低剂量和中剂量则未产生明显效果。

基于HPK1抑制剂（HPK1i）能在体外逆转¹⁷⁷Lu诱导的T细胞抑制作用这一发现，作者进一步评估了将¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4与HPK1i联合使用是否能在体内产生协同抗肿瘤效应。为降低辐射剂量相关的潜在不良反应风险，本研究选用低剂量（3.7 MBq）的¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4进行实验。携带B16F10异种移植瘤的C57Bl/6J小鼠被随机分为三组：单次注射¹⁷⁷Lu- DOTA -CEMJ4、单次注射HPK1i（10 mg/kg）或联合两种治疗方案。与未治疗对照组相比，无论是低剂量¹⁷⁷Lu-DOTACEMJ4还是单独使用HPK1i均未显著抑制肿瘤生长。正如预期，联合疗法实验结果显示肿瘤体积显著减小，平均体积仅为445.05 mm³，明显低于其他组别（图7C-D）。治疗效果进一步通过肿瘤组织的 TUNEL（细胞凋亡标志物）、 γ -H2AX（DNA损伤标志物）及Ki67（细胞增殖标志物）免疫荧光染色结果得到证实（图7E）。

结果表明，177Lu-DOTACEMJ4与HPK1抑制剂联合疗法能显著促进肿瘤细胞凋亡、增加肿瘤DNA损伤并抑制肿瘤细胞增殖，从而展现出显著的抗肿瘤疗效。

作者进一步研究了联合疗法对体内免疫反应的影响。与体外实验中177Lu- DOTA -CEMJ4抑制T细胞活化的作用相反，体内单用177Lu- DOTA -CEMJ4实际上增加了 TME 内CD3+/CD4+及CD3+/CD8+ T细胞的浸润数量，而与对照组相比，对F4/80+/CD86+ M1型和F4/80+/CD163+ M2型巨噬细胞未见显著影响。HPK1i单药治疗也观察到类似结果。然而，177Lu- DOTA -CEMJ4与HPK1i联合治疗不仅进一步增强了CD3+/CD4+、CD3+/CD8+ T细胞及M1型巨噬细胞的浸润，还降低了PD-1+ CD8+ T细胞的比例（图7F）。同时，M1型巨噬细胞标志物F4/80与iNOS的共染色显示联合治疗组中这些标志物表达显著升高，表明 TME 中的巨噬细胞已向抗肿瘤的M1表型分化。

作者通过体重监测及主要器官的H&E染色评估了177Lu- DOTA -CEMJ4联合HPK1抑制剂的安全性。联合治疗后，所有实验组小鼠均未出现显著体重下降）。此外，肝脏酶水平（特别是丙氨酸氨基转移酶[ALT]）以及肾功能指标（包括血尿素氮[BUN]和肌酐[Crea]）均保持稳定，未出现显著变化。肝、肾、心脏、脾脏及肺组织的H&E染色结果也表明，177Lu- DOTA -CEMJ4与HPK1抑制剂联合治疗未引起全身毒性反应。

研究结论

本研究确定CEMJ4是一种具有前景的肽类配体，适用于肿瘤靶向放射性核素递送，并强调了放射性核素疗法与免疫疗法联合应用于诊疗一体化治疗中提升治疗精准度和疗效的临床潜力。

参考文献：doi.org/10.1007/s13402-025-01105-1